異檸檬酸裂解酶（ICL)測試盒
測定意義與原理
測定意義
ICL（EC4.1.3.1）主要存在于植物和微生物中，是乙醛酸循環(huán)的關(guān)鍵酶之一，在油料作物種子萌發(fā)過程中，通過乙醛酸循環(huán)及其他過程將脂肪轉(zhuǎn)變成碳水化合物：臨床診斷：診斷和監(jiān)測線粒體疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管疾病等疾病監(jiān)測：評估細(xì)胞能量代謝狀態(tài)、組織損傷程度和治療效果生物學(xué)研究：了解線粒體功能、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞增殖機制藥物研發(fā)：篩選線粒體靶向藥物，用于治療線粒體疾病和神經(jīng)退行性疾病
測定原理
ICL催化異檸檬酸降解為乙醛酸和琥珀酸，乙醛酸和NADH在LDH的作用下生成乙醇和NAD，NADH在340nm下有特征吸收峰，監(jiān)測340nm吸光度的減小速率可間接反應(yīng)ICL活性。反應(yīng)式如下： 異檸檬酸→ICL乙醛酸+琥珀酸異檸檬酸ICL乙醛酸+琥珀酸 乙醛酸+NADH+H+→LDH乙醇酸+NAD+乙醛酸+NADH+H+LDH乙醇酸+NAD+
試劑盒組成
組分 規(guī)格 作用說明
試劑一 液體100mL×1瓶 含提取液，用于提取樣本中的ICL
試劑二 液體100mL×1瓶 含提取液，用于提取樣本中的ICL
試劑三 液體1.5mL×1瓶 含激活劑，用于提高ICL活性
試劑四 液體25mL×1瓶 含緩沖液，用于配制工作液
試劑五 液體1mL×1支 含NADH溶液，反應(yīng)底物
試劑六 粉劑×1瓶 含LDH，反應(yīng)催化劑
標(biāo)準(zhǔn)品 1mL×1支 含ICL標(biāo)準(zhǔn)液，用于建立標(biāo)準(zhǔn)曲線
自備儀器與試劑
必備儀器
紫外分光光度法/微量法：紫外分光光度計/酶標(biāo)儀、臺式離心機、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰、無水乙醇和蒸餾水
比色法：可見分光光度計、臺式離心機、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水
必備耗材
離心管（1.5mL/10mL）、一次性吸頭、研缽/組織勻漿器、超聲破碎儀
自備試劑：蒸餾水/去離子水、生理鹽水
樣本前處理方法
動植物組織樣本取樣：準(zhǔn)確稱取0.1g組織，用生理鹽水洗凈，濾紙吸干勻漿：加入1mL試劑一和10μL試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿低速離心：600g，4℃離心5min，棄沉淀，保留上清液高速離心：11000g，4℃離心10min，棄上清液，沉淀即為線粒體線粒體破碎：加入200μL試劑二和2μL試劑三，超聲波破碎（冰浴，功率20%或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）檢測：裂解液用于ICL酶活性測定
細(xì)胞樣本收集：收集500萬細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清破碎：加入1mL試劑一和10μL試劑三，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20%或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）離心：8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測
血清/血漿樣本
血清/血漿樣本可直接檢測；若濃度過高，用提取液稀釋10-20倍
測定操作步驟
儀器預(yù)熱：分光光度計/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至340nm，蒸餾水調(diào)零工作液配制：臨用前將試劑五轉(zhuǎn)移到試劑四中混合溶解，37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）孵育5min；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融樣本測定：
在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本、200μL工作液和15μL試劑六，混勻
記錄340nm處初始吸光值A(chǔ)1和2min后的吸光值A(chǔ)2，計算ΔA=A1-A2標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：將ICL標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成0、10、20、30、40、50U/L系列濃度，同樣處理，測定2min內(nèi)吸光值變化，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線
結(jié)果計算方法
單位定義
U/mg prot：每毫克組織蛋白每分鐘消耗1nmol NADH的酶量
U/g 鮮重：每克鮮重樣本每分鐘消耗1nmol NADH的酶量
U/L：每升樣本每分鐘消耗1nmol NADH的酶量
計算公式
ICL活性(U/mg prot)=ΔA×V總ε×d×Cpr×T×V樣×109ICL活性(U/mg prot)=ε×d×Cpr×T×V樣ΔA×V總×109
ΔA：樣本管吸光度變化值
V總：反應(yīng)體系總體積（L）
ε：NADH摩爾消光系數(shù)（6.22×103 L/mol/cm）
d：比色皿光徑（cm）
Cpr：樣本蛋白濃度（mg/mL）
T：反應(yīng)時間（min）
V樣：樣本體積（L）
性能指標(biāo)
指標(biāo) 紫外分光光度法/微量法/比色法
線性范圍 0~50U/L
最低檢測限 ≤0.1U/L
回收率 90%~110%
批內(nèi)精密度 CV≤2.3%
批間精密度 CV≤5.34%
穩(wěn)定性 2-8℃保存6-12個月
注意事項
樣本處理：
樣本需新鮮制備，避免ICL失活；-20℃可保存3個月
組織樣本需冰浴勻漿，避免酶失活
超聲波破碎時需控制功率和時間，避免線粒體過度破碎
試劑使用：
工作液需現(xiàn)配現(xiàn)用，避免氧化失效
不同批號試劑不能混用，需重新繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線
反應(yīng)液含有毒性物質(zhì)，避免直接用手接觸
測定過程：
反應(yīng)溫度需嚴(yán)格控制在37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）
加入樣品啟動反應(yīng)后3秒內(nèi)即刻比色測定
若吸光度值超出線性范圍，需稀釋樣本后重新測定
質(zhì)量控制：
每次實驗需設(shè)置空白對照和質(zhì)控樣本
定期校準(zhǔn)儀器，確保檢測結(jié)果準(zhǔn)確性
若結(jié)果偏差較大，需檢查試劑是否變質(zhì)或樣本處理是否正確
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關(guān)鍵字： 異檸檬酸裂解酶;ICL;測試盒;
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