商品屬性
產(chǎn)品名稱 | γ谷氨酰半胱氨酸連接酶（GCL）測試盒 | 產(chǎn)品貨號 | BH-961135 |
規(guī)格 | 100管/96樣、50管/48樣 | 產(chǎn)品分類 | 谷胱甘肽系列 |
測試方法 | 微量法、可見分光光度法 | 用途 | 僅供科研實驗 |
測定意義與原理
測定意義
γ谷氨酰半胱氨酸連接酶（GCL，EC6.3.2.2）是谷胱甘肽（GSH）合成的限速酶，主要功能包括：谷胱甘肽合成：催化谷氨酸和半胱氨酸合成γ-谷氨酰半胱氨酸，為GSH合成提供前體氧化還原調(diào)節(jié)：GSH是細胞內(nèi)最重要的抗氧化劑，GCL活性直接影響細胞內(nèi)GSH含量和氧化還原狀態(tài)疾病關(guān)聯(lián)：GCL活性異常與多種疾病相關(guān)，如腫瘤、糖尿病、心血管疾病、神經(jīng)退行性疾病等應激響應：GCL基因表達受多種因素調(diào)節(jié)，如氧化劑、抗氧化劑、生長因子和炎癥因子等
測定原理
在ATP和Mg2?存在下，GCL催化谷氨酸和半胱氨酸合成γ-谷氨酰半胱氨酸，同時ATP去磷酸化產(chǎn)生無機磷分子： Glu+Cys+ATP→GCLγ-Glu-Cys+ADP+PiGlu+Cys+ATPGCLγ-Glu-Cys+ADP+Pi 通過測定無機磷毫摩爾數(shù)，即可計算出GCL活性。
自備儀器與試劑
必備儀器
可見分光光度計/酶標儀（660nm檢測通道）
臺式高速離心機（≥8000g）
恒溫水浴鍋（控溫精度±0.5℃）
可調(diào)式移液器（0.5-10μL、10-100μL、100-1000μL）
超聲破碎儀（用于細胞/細菌樣本）
必備耗材
1mL玻璃比色皿/96孔板
離心管（1.5mL、10mL）
一次性無菌吸頭
研缽/組織勻漿器（冰浴專用）
自備試劑
蒸餾水/去離子水
生理鹽水（0.85% NaCl）
濃硫酸（用于無機磷測定）
樣本前處理方法
動植物組織樣本取新鮮組織，用生理鹽水沖洗干凈，濾紙吸干水分稱取0.1g組織，加入1mL預冷提取液，冰浴勻漿8000g 4℃離心10min，取上清液置冰上待測若酶活性過高，可用提取液稀釋1-5倍后測定
細菌/細胞樣本收集對數(shù)生長期細菌/細胞，8000g 4℃離心5min棄上清按照細菌或細胞數(shù)量(10?個):提取液體積(mL)=500~1000:1的比例（建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎（功率20%或200W，超聲3s，間隔10s，重復30次）8000g 4℃離心10min，取上清液置冰上待測
血清/血漿樣本血清樣本：血液凝固后3000g 4℃離心10min，取血清上清血漿樣本：加入抗凝劑（肝素/EDTA）后3000g 4℃離心10min，取上清樣本可直接檢測，無需提取處理；活性過高時可用生理鹽水稀釋
測定操作步驟
分光光度法操作
試劑準備：
試劑一：液體25mL×1瓶，4℃保存
試劑二：液體1mL×1支，-20℃保存
試劑三：粉劑×1支，-20℃保存，用時加500μL蒸餾水溶解
試劑四：粉劑×1支，-20℃保存，用時加500μL蒸餾水溶解
檢測工作液：試劑一1.0mL + 試劑二50μL + 試劑三50μL + 試劑四50μL，現(xiàn)配現(xiàn)用
檢測工作液置于37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）水浴中預熱10min以上
預溫育：
分光光度計預熱30min，調(diào)節(jié)波長到660nm，蒸餾水調(diào)零
反應啟動：
空白管：取比色皿，依次加入工作液900μL + 提取液100μL
混勻，在660nm波長下記錄10min（A1）時的吸光度值
測定管：取比色皿，依次加入工作液900μL + 樣本100μL
混勻，在660nm波長下記錄10min（A2）時的吸光度值
計算ΔA：ΔA = A2 - A1
微量法（酶標儀）操作96孔板每孔加入：工作液90μL + 樣本10μL37℃預溫育10min，加入樣本后立即混勻測定660nm處吸光度值計算樣本吸光度與空白吸光度的差值（ΔA）
酶活力計算方法
單位定義
U/g鮮重：每g組織鮮重每分鐘生成1μmol無機磷的酶量
U/mL：每mL樣本每分鐘生成1μmol無機磷的酶量
U/mgprot：每mg蛋白每分鐘生成1μmol無機磷的酶量
計算公式
GCL活性(U/mgprot)=ΔA×V反總×V樣總×1000ε×d×Cpr×V樣測×TGCL活性(U/mgprot)=ε×d×Cpr×V樣測×TΔA×V反總×V樣總×1000
ΔA：10min內(nèi)吸光度變化值
V反總：反應體系總體積（1.0mL）
V樣總：樣本提取液總體積（mL）
ε：無機磷摩爾消光系數(shù)（1.8×103 L/(mol·cm)）
d：比色皿光徑（1cm）
Cpr：樣本蛋白濃度（mg/mL）
V樣測：測定時加入樣本體積（0.1mL）
T：反應時間（10min）
簡化公式
組織樣本：GCL（U/g鮮重）= 5.56 × ΔA ÷ W
液體樣本：GCL（U/mL）= 5.56 × ΔA
蛋白樣本：GCL（U/mgprot）= 5.56 × ΔA ÷ Cpr
注意事項
樣本處理：
樣本需新鮮制備，避免酶失活；-80℃可保存1個月
勻漿與超聲破碎需在冰浴中進行，控制溫度在0-4℃
樣本需避免氧化，處理過程中盡量減少與空氣接觸
試劑使用：
ATP溶液對光敏感，配制后需避光保存
檢測工作液需現(xiàn)配現(xiàn)用，避免ATP降解
不同批號試劑不能混用，需重新繪制標準曲線
測定過程：
反應溫度嚴格控制在37℃（哺乳動物）或25℃（植物）
若ΔA值大于0.5，需稀釋樣本后重新測定
每個樣本需設(shè)置3個平行孔，取平均值計算
質(zhì)量控制：
每次實驗設(shè)置空白對照（提取液替代樣本）和陽性對照
若結(jié)果偏差較大，需檢查試劑是否變質(zhì)、樣本處理是否正確
正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定
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關(guān)鍵字： γ谷氨酰半胱氨酸連接酶;GCL;測試盒;
派瑞曼pyram?是上海博湖生物科技有限公司（Shanghai Bohu Biological Technology Co., Ltd.，China）的產(chǎn)品品牌。
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