α淀粉酶測試盒

測定意義與原理

測定意義

α-淀粉酶（α-Amylase, EC3.2.1.1）是一種水解酶類，廣泛存在于動物唾液、胰液和植物種子中。在人體內(nèi)主要由唾液腺和胰腺分泌，是診斷胰腺疾病的重要指標(biāo)。其活性檢測具有重要意義：臨床診斷：診斷和監(jiān)測急性胰腺炎、慢性胰腺炎、胰腺癌、腮腺炎、膽管炎、膽囊炎等疾病疾病監(jiān)測：評估胰腺功能、炎癥狀態(tài)和治療效果生物學(xué)研究：了解消化系統(tǒng)功能、碳水化合物代謝和食物消化機制食品檢測：檢測食品中α-淀粉酶活性、食品質(zhì)量和保質(zhì)期農(nóng)業(yè)研究：研究植物種子萌發(fā)機制、抗逆性和品質(zhì)改良

測定原理

碘-淀粉比色法：α-淀粉酶催化淀粉水解，產(chǎn)生麥芽糖、葡萄糖等還原糖，未被水解的淀粉與碘液反應(yīng)生成藍(lán)色復(fù)合物。通過測定660nm處吸光度變化，計算α-淀粉酶活性。反應(yīng)式如下： (C6H10O5)n+nH2O→α-淀粉酶nC6H12O6(C6H10O5)n+nH2Oα-淀粉酶nC6H12O6 淀粉+碘液→藍(lán)色復(fù)合物淀粉+碘液→藍(lán)色復(fù)合物

連續(xù)監(jiān)測法/速率法：α-淀粉酶催化底物對硝基苯麥芽七糖苷（PNP-G7）水解，產(chǎn)生對硝基苯酚（PNP）和麥芽寡糖。對硝基苯酚在405nm處有特征吸收峰，通過測定吸光度變化速率，計算α-淀粉酶活性。反應(yīng)式如下： PNP-G7→α-淀粉酶PNP+麥芽寡糖PNP-G7α-淀粉酶PNP+麥芽寡糖

ELISA法：采用雙抗體夾心法，將α-淀粉酶與特異性抗體結(jié)合，通過酶標(biāo)二抗檢測結(jié)合的α-淀粉酶，根據(jù)吸光度值計算α-淀粉酶含量。

試劑盒組成

碘-淀粉比色法試劑盒

組分 規(guī)格 作用說明

提取液 液體60mL×1瓶 用于提取樣本中的α-淀粉酶

試劑一 液體45mL×1瓶 含緩沖液和底物淀粉溶液

試劑二 液體10mL×1瓶 含碘液和碘化鉀溶液

標(biāo)準(zhǔn)品 液體1mL×6管 含0-100U/L α-淀粉酶標(biāo)準(zhǔn)品

連續(xù)監(jiān)測法/速率法試劑盒

組分 規(guī)格 作用說明

試劑一 液體20mL×1瓶 含緩沖液、氯化鈉、氯化鈣等

試劑二 液體10mL×1瓶 含底物對硝基苯麥芽七糖苷（PNP-G7）

標(biāo)準(zhǔn)品 液體1mL×6管 含0-200U/L α-淀粉酶標(biāo)準(zhǔn)品

ELISA法試劑盒

組分 規(guī)格 作用說明

包被板 96孔×1塊 預(yù)包被抗α-淀粉酶單克隆抗體

酶標(biāo)抗體 液體6mL×1瓶 含HRP標(biāo)記抗α-淀粉酶抗體

標(biāo)準(zhǔn)品 液體1mL×6管 含0.1-10ng/mL α-淀粉酶標(biāo)準(zhǔn)品

樣本稀釋液 10mL×1瓶 用于稀釋樣本和標(biāo)準(zhǔn)品

顯色劑A液 6mL×1瓶 含過氧化氫溶液

顯色劑B液 6mL×1瓶 含TMB溶液

終止液 6mL×1瓶 含硫酸溶液

20倍濃縮洗滌液 20mL×1瓶 用于洗滌酶標(biāo)板

自備儀器與試劑

必備儀器

碘-淀粉比色法：可見分光光度計/酶標(biāo)儀、臺式離心機、恒溫水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL玻璃比色皿/96孔板、研缽、電子天平

連續(xù)監(jiān)測法/速率法：可見分光光度計/酶標(biāo)儀、臺式離心機、恒溫水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL玻璃比色皿/96孔板、研缽、電子天平

ELISA法：酶標(biāo)儀（450nm檢測通道）、96孔板、37℃恒溫箱、洗板機、可調(diào)式移液器、臺式離心機

必備耗材

離心管（1.5mL/10mL）、一次性吸頭、研缽/組織勻漿器、超聲破碎儀

自備試劑：蒸餾水/去離子水、生理鹽水

樣本前處理方法

血清/血漿樣本采集：使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管，操作過程中避免任何細(xì)胞刺激，收集血液后，3000轉(zhuǎn)離心10分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離保存：如果樣本收集后不及時檢測，請按一次用量分裝，凍存于-20°C，避免反復(fù)凍融，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍處理：直接檢測。

組織樣本取樣：將組織加入適量生理鹽水搗碎勻漿：按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿離心：8000g 4℃離心10分鐘取上清保存：如果樣本收集后不及時檢測，請按一次用量分裝，凍存于-20°C，避免反復(fù)凍融

細(xì)胞/微生物樣本收集：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清破碎：按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10?個）:提取液體積(mL)為500~1000:1的比例（建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20%或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）離心：8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測

唾液/尿液樣本采集：直接收集清晨空腹唾液或中段尿液稀釋：唾液按1:10稀釋，尿液按1:2稀釋檢測：直接檢測。

測定操作步驟

碘-淀粉比色法操作儀器預(yù)熱：可見分光光度計/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長到660nm，蒸餾水調(diào)零試劑配制：

淀粉溶液：將淀粉溶解于沸水中，冷卻后定容至100mL

碘液：將碘和碘化鉀溶解于蒸餾水中，定容至100mL樣本測定：

試劑名稱(μL) 空白管 測定管

蒸餾水/樣本 100 100

淀粉溶液 200 200

緩沖液 200 200

混勻后37℃水浴10min，加入碘液100μL，蒸餾水400μL，混勻后記錄660nm處的吸光值A(chǔ)空白和A測定標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：將α-淀粉酶標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成0、10、20、40、60、80、100U/L系列濃度，同樣處理，測定660nm處的吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

連續(xù)監(jiān)測法/速率法操作儀器預(yù)熱：可見分光光度計/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長到405nm，蒸餾水調(diào)零試劑配制：

工作液：將試劑一和試劑二按9:1比例混合樣本測定：

試劑名稱(μL) 空白管 測定管

蒸餾水/樣本 20 20

工作液 700 700

混勻后立即記錄405nm處的吸光值A(chǔ)0，37℃水浴10min后記錄吸光值A(chǔ)10，計算ΔA=A10-A0標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：將α-淀粉酶標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成0、20、40、80、120、160、200U/L系列濃度，同樣處理，測定405nm處的吸光值變化，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

ELISA法操作試劑準(zhǔn)備：將試劑盒從冷藏環(huán)境中取出，室溫平衡15-30分鐘；將20×洗滌緩沖液用蒸餾水20倍稀釋后備用加樣：

從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃

設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL；樣本孔中加入待測樣本50μL；空白孔不加溫育：除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入HRP標(biāo)記的檢測抗體100μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min洗滌：棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液（350μL），靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次（也可用洗板機洗板）顯色：每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min終止：每孔加入終止液50μL，15min內(nèi)，在450nm波長處測定各孔的OD值結(jié)果計算：繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，按曲線方程計算樣本濃度

結(jié)果計算方法

單位定義

U/L：每升樣本每分鐘催化水解1mg淀粉的酶量（碘-淀粉比色法）

U/L：每升樣本每分鐘催化水解1μmol底物的酶量（連續(xù)監(jiān)測法/速率法）

ng/mL：每毫升樣本中α-淀粉酶的含量（ELISA法）

碘-淀粉比色法計算公式

α-淀粉酶活性(U/L)=A空白?A測定A空白?A標(biāo)準(zhǔn)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度×稀釋倍數(shù)×V總V樣×1T×1000α-淀粉酶活性(U/L)=A空白?A標(biāo)準(zhǔn)A空白?A測定×標(biāo)準(zhǔn)品濃度×稀釋倍數(shù)×V樣V總×T1×1000

A測定：樣本管吸光度值

A空白：空白管吸光度值

A標(biāo)準(zhǔn)：標(biāo)準(zhǔn)管吸光度值

標(biāo)準(zhǔn)品濃度：通常為1U/mL

V總：反應(yīng)體系總體積（mL）

V樣：樣本體積（mL）

T：反應(yīng)時間（min）

連續(xù)監(jiān)測法/速率法計算公式

α-淀粉酶活性(U/L)=ΔA×V總ε×d×T×V樣×106α-淀粉酶活性(U/L)=ε×d×T×V樣ΔA×V總×106

ΔA：樣本管吸光度變化值

V總：反應(yīng)體系總體積（L）

ε：對硝基苯酚摩爾消光系數(shù)（1.8×10? L/mol/cm）

d：比色皿光徑（cm）

T：反應(yīng)時間（min）

V樣：樣本體積（L）

ELISA法計算公式

α-淀粉酶含量(ng/mL)=樣本OD值?空白OD值標(biāo)準(zhǔn)品OD值?空白OD值×標(biāo)準(zhǔn)品濃度×稀釋倍數(shù)α-淀粉酶含量(ng/mL)=標(biāo)準(zhǔn)品OD值?空白OD值樣本OD值?空白OD值×標(biāo)準(zhǔn)品濃度×稀釋倍數(shù)

性能指標(biāo)

指標(biāo) 碘-淀粉比色法 連續(xù)監(jiān)測法/速率法 ELISA法

線性范圍 0~100U/L 0~200U/L 0.1-10ng/mL

最低檢測限 ≤1U/L ≤0.1U/L ≤0.05ng/mL

回收率 90%~110% 90%~110% 90%~110%

批內(nèi)精密度 CV≤5.0% CV≤2.0% CV≤3.8%

批間精密度 CV≤8.0% CV≤5.0% CV≤8.5%

穩(wěn)定性 2-8℃保存6-12個月 2-8℃保存6-12個月 2-8℃保存6-12個月

注意事項

樣本處理：

樣本需新鮮制備，避免α-淀粉酶失活；-20℃可保存3個月

組織樣本需冰浴勻漿，避免酶失活

液體樣本需避免溶血和細(xì)菌污染

唾液和尿液樣本需稀釋后檢測

試劑使用：

試劑需臨用前配制，避免氧化失效

不同批號試劑不能混用，需重新繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

標(biāo)準(zhǔn)品需4℃保存，避免反復(fù)凍融

碘液需避光保存，避免分解

測定過程：

反應(yīng)溫度需嚴(yán)格控制在37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）

加入樣品啟動反應(yīng)后3秒內(nèi)即刻比色測定

若吸光度值超出線性范圍，需稀釋樣本后重新測定

質(zhì)量控制：

每次實驗需設(shè)置空白對照和質(zhì)控樣本

定期校準(zhǔn)儀器，確保檢測結(jié)果準(zhǔn)確性

若結(jié)果偏差較大，需檢查試劑是否變質(zhì)或樣本處理是否正確

其他注意事項：

實驗中不用的板條應(yīng)立即放回包裝袋中，密封保存，以免變質(zhì)

使用干凈的塑料容器配置洗滌液

洗滌酶標(biāo)板時應(yīng)充分拍干，不要將吸水紙直接放入酶標(biāo)反應(yīng)孔中吸水

公司正在出售的產(chǎn)品