商品屬性

測定意義與原理

測定意義

一氧化氮（NO）是一種重要的生物活性分子，具有廣泛的生理和病理作用：生理學(xué)：參與神經(jīng)傳導(dǎo)、血管舒張、免疫調(diào)節(jié)等多種生理過程醫(yī)學(xué)：與心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、腫瘤等疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)環(huán)境學(xué)：是大氣污染物之一，影響空氣質(zhì)量和氣候變化營養(yǎng)學(xué)：反映食品中硝酸鹽和亞硝酸鹽的含量，評估食品質(zhì)量和安全性

測定原理

硝酸還原酶法

NO化學(xué)性質(zhì)活潑，體內(nèi)代謝轉(zhuǎn)化為硝酸鹽（NO3ˉ）和亞硝酸鹽（NO2ˉ），血清（NO3ˉ）與（NO2ˉ）濃度之和（NO3ˉ+NO2ˉ）才能準(zhǔn)確代表體內(nèi)（NO）水平。本法利用硝酸還原酶特異性將NO3ˉ還原為NO2ˉ，通過顯色深淺測定其濃度的高低。

Griess法

NO在體內(nèi)代謝生成的NO2ˉ可與Griess試劑反應(yīng)生成有色產(chǎn)物，通過測定吸光度計算NO含量。反應(yīng)式如下： NO2?+Griess試劑→有色產(chǎn)物NO2?+Griess試劑→有色產(chǎn)物

ELISA法

應(yīng)用雙抗體夾心法測定標(biāo)本中NO水平。用純化的NO抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入NO，再與HRP標(biāo)記的羊抗鼠抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的NO呈正相關(guān)。

試劑盒組成

組分 規(guī)格 作用說明

試劑一 液體100mL×1瓶 含緩沖液，用于樣本提取，-20℃保存

試劑二 液體20mL×1瓶 含反應(yīng)試劑，-20℃保存

試劑三 液體25mL×1瓶 含反應(yīng)試劑，室溫保存

試劑四 液體25mL×1瓶 含反應(yīng)試劑，-20℃保存

試劑五 粉劑×1瓶 含顯色劑，需臨用前加入20mL熱蒸餾水溶解，避光保存

試劑六 粉劑×1瓶 含顯色劑，需臨用前加入8mL蒸餾水溶解，避光冷藏保存

試劑七 液體8mL×1瓶 含顯色劑，室溫保存

標(biāo)準(zhǔn)品 液體1mL×1支 含10nmol/L NO標(biāo)準(zhǔn)品，用于建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，-20℃以下保存

自備儀器與試劑

必備儀器

分光光度法：紫外分光光度計/酶標(biāo)儀/半自動生化分析儀（比色測定波長為550nm）

ELISA法：酶標(biāo)儀（450nm檢測通道）

通用：恒溫水浴箱或氣浴箱（孵育溫度為37℃）、漩渦混勻器、臺式離心機(jī)、微量移液器

組織樣本：研缽/組織勻漿器

必備耗材

離心管（1.5mL/10mL）、一次性吸頭、研缽/組織勻漿器

自備試劑：蒸餾水/去離子水、生理鹽水、甲苯（不允許快遞）

樣本前處理方法

血清/血漿樣本血清：使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管，操作過程中避免任何細(xì)胞刺激，收集血液后，3000轉(zhuǎn)離心10分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離。血漿：EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝，3000轉(zhuǎn)離心10分鐘去除顆粒和聚合物。保存：如果樣本收集后不及時檢測，請按一次用量分裝，凍存于-20℃，避免反復(fù)凍融，在室溫下解凍并使樣品均勻地充分解凍。

組織樣本動物組織：準(zhǔn)確稱取0.1g組織，加入1mL試劑一，冰浴勻漿植物組織：稱取0.1g組織，加入1mL試劑一，冰浴研磨細(xì)胞樣本：收集500萬細(xì)胞，加入1mL試劑一，冰浴超聲波破碎離心處理：12000g 4℃離心15min，取上清液置冰上待測樣本稀釋：若酶活性過高，用提取液稀釋1-10倍后測定

尿液/腦脊液樣本用無菌管收集樣本，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）仔細(xì)收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心檢測細(xì)胞內(nèi)的成份時，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度達(dá)到100萬/ml左右，通過反復(fù)凍融，以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份

測定操作步驟

硝酸還原酶法操作試劑準(zhǔn)備：按試劑一:試劑二=1:1的比例配制混合試劑，用多少配多少，配好后充分混合后待用；顯色劑的配制：試劑五:試劑六:試劑七=1:1:1，需多少配多少樣本測定：

按步驟加入樣本和R1、R2混合試劑，37℃水浴60分鐘

加入R3、R4，抽提室溫靜置40分鐘，3500~4000轉(zhuǎn)/分，離心10分鐘

取上清0.5ml，加入顯色劑，靜置10分鐘，550nm波長，0.5cm光徑，比色標(biāo)準(zhǔn)曲線：將標(biāo)準(zhǔn)品用蒸餾水稀釋成0、0.5、1、2、4、8、16μmol/L系列濃度，同樣處理

ELISA法操作標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋：在酶標(biāo)包被板上設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔10孔，在第一、第二孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品100μl，然后在第一、第二孔中加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl，混勻；然后從第一孔、第二孔中各取100μl分別加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl，混勻；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl棄掉，再各取50μl分別加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50ul，混勻；混勻后從第五、第六孔中各取50μl分別加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl，混勻后從第七、第八孔中分別取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl，混勻后從第九第十孔中各取50μl棄掉。（稀釋后各孔加樣量都為50μl，濃度分別為30μmol/L,20μmol/L,10μmol/L,5μmol/L,2.5μmol/L）。加樣：分別設(shè)空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）、待測樣品孔。在酶標(biāo)包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl（樣品最終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50μl，空白孔除外。顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘。終止：每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)（此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。測定：以空白空調(diào)零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。測定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行。

結(jié)果計算方法

單位定義

μmol/L：樣本中一氧化氮的濃度

μmol/g：每克樣本中一氧化氮的含量

硝酸還原酶法計算標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：以NO2-濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線NO2-含量計算：根據(jù)樣品吸光度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得NO2-濃度NO總含量計算：NO總含量 = NO2-含量 + NO3-含量（通過硝酸還原酶還原后測定）

ELISA法計算標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線樣本NO濃度計算：根據(jù)樣本OD值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得NO濃度，再乘以稀釋倍數(shù)

性能指標(biāo)

指標(biāo) 要求

線性范圍 0~16μmol/L，線性相關(guān)系數(shù)r≥0.995

最低檢測限 ≤0.1μmol/L

回收率 90%~110%

批內(nèi)精密度 CV≤5.0%

批間精密度 CV≤8.0%

穩(wěn)定性 2-8℃保存12個月，活性保留≥90%

注意事項

樣本處理：

樣本需新鮮制備，避免NO被氧化失活；-20℃可保存3個月

血清(漿)可直接測定，紅細(xì)胞需按照試劑盒中說明書上紅細(xì)胞的測定方法進(jìn)行提取后測定

動物組織樣本可用生理鹽水按重量體積比制備成組織勻漿液，離心取上清測定

試劑使用：

混合試劑需現(xiàn)配現(xiàn)用，避免反應(yīng)失效

顯色劑需臨用前配制，避光保存，天冷會有結(jié)晶析出，再次使用時，放在100℃水浴，反復(fù)搖動溶解后使用

不同批號試劑不能混用，需重新繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

測定過程：

反應(yīng)溫度需嚴(yán)格控制在37℃，反應(yīng)時間60分鐘

測定需在37℃（哺乳動物）或25℃（植物）條件下進(jìn)行

若吸光度值超出線性范圍，需稀釋樣本后重新測定

質(zhì)量控制：

每次實(shí)驗(yàn)需設(shè)置空白對照和質(zhì)控樣本

定期校準(zhǔn)儀器，確保檢測結(jié)果準(zhǔn)確性

若結(jié)果偏差較大，需檢查試劑是否變質(zhì)或樣本處理是否正確

公司正在出售的產(chǎn)品