商品屬性
產(chǎn)品名稱 | 谷丙轉(zhuǎn)氨酶/丙氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶（GPT/ALT)測(cè)試盒 | 產(chǎn)品貨號(hào) | BH-9611108 |
規(guī)格 | 100管/48樣、50管/24樣 | 產(chǎn)品分類 | 氨基酸代謝系列 |
測(cè)試方法 | 微量法、可見(jiàn)分光光度法 | 用途 | 僅供科研實(shí)驗(yàn) |
測(cè)定意義與原理
測(cè)定意義
谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT/ALT）是參與人體蛋白質(zhì)新陳代謝的重要酶類，其測(cè)定具有重要的臨床和科研價(jià)值：臨床診斷：診斷和監(jiān)測(cè)肝臟疾病，如肝炎、肝硬化、肝癌等疾病監(jiān)測(cè)：評(píng)估心肌梗死、胰腺炎、膽囊炎等疾病的損傷程度藥物監(jiān)測(cè)：監(jiān)測(cè)藥物對(duì)肝臟的毒性作用科研應(yīng)用：研究肝臟疾病的發(fā)病機(jī)制和藥物療效
測(cè)定原理
賴氏比色法
ALT催化丙氨酸和α-酮戊二酸轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)，生成丙酮酸和谷氨酸。丙酮酸與2,4-二硝基苯肼反應(yīng)生成2,4-二硝基苯腙，在堿性條件下顯棕紅色，在505nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，其吸光度與ALT活性成正比。反應(yīng)式如下： 丙氨酸+α-酮戊二酸→ALT丙酮酸+谷氨酸丙氨酸+α-酮戊二酸ALT丙酮酸+谷氨酸 丙酮酸+2,4-二硝基苯肼→堿性條件丙酮酸-2,4-二硝基苯腙(棕紅色)丙酮酸+2,4-二硝基苯肼堿性條件丙酮酸-2,4-二硝基苯腙(棕紅色)
IFCC推薦方法（紫外比色法）
ALT催化L-丙氨酸與α-酮戊二酸的轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)，生成丙酮酸和谷氨酸。丙酮酸在乳酸脫氫酶（LDH）催化下，與NADH反應(yīng)生成L-乳酸和NAD+，通過(guò)監(jiān)測(cè)340nm波長(zhǎng)下NADH吸光度下降速率計(jì)算ALT活性。反應(yīng)式如下： L-丙氨酸+α-酮戊二酸→ALT丙酮酸+L-谷氨酸L-丙氨酸+α-酮戊二酸ALT丙酮酸+L-谷氨酸 丙酮酸+NADH+H+→LDHL-乳酸+NAD+丙酮酸+NADH+H+LDHL-乳酸+NAD+
ELISA法
采用雙抗體夾心原理，以特異性抗ALT抗體作為捕獲抗體，酶標(biāo)記抗ALT抗體作為檢測(cè)抗體，通過(guò)底物顯色反應(yīng)測(cè)定ALT活性。
試劑盒組成
賴氏法試劑盒
組分 規(guī)格 作用說(shuō)明
試劑一 液體100mL×1瓶 含0.1mol/L丙氨酸-0.02mol/L α-酮戊二酸緩沖液（pH7.4）
試劑二 液體50mL×1瓶 含2,4-二硝基苯肼溶液
試劑三 液體50mL×1瓶 含0.4mol/L NaOH溶液
標(biāo)準(zhǔn)品 液體1mL×1支 含200U/L ALT標(biāo)準(zhǔn)品
IFCC推薦方法試劑盒
組分 規(guī)格 作用說(shuō)明
試劑一 液體100mL×1瓶 含L-丙氨酸、α-酮戊二酸、NADH、LDH、緩沖液（pH7.5）
試劑二 液體50mL×1瓶 含啟動(dòng)試劑
標(biāo)準(zhǔn)品 液體1mL×1支 含200U/L ALT標(biāo)準(zhǔn)品
ELISA法試劑盒
組分 規(guī)格 作用說(shuō)明
包被板 96孔×1塊 預(yù)包被抗ALT抗體
酶標(biāo)抗體 液體6mL×1瓶 含HRP標(biāo)記抗ALT抗體
標(biāo)準(zhǔn)品 液體1mL×2瓶 含0U/L、20U/L、50U/L、100U/L、200U/L、400U/L ALT標(biāo)準(zhǔn)品
樣本稀釋液 液體20mL×1瓶 含PBS緩沖液（pH7.4）
洗滌液 液體20mL×1瓶 含0.05% Tween-20的PBS緩沖液
底物液 液體6mL×1瓶 含TMB底物液
終止液 液體6mL×1瓶 含2mol/L H?SO?溶液
自備儀器與試劑
必備儀器
賴氏法：可見(jiàn)分光光度計(jì)（505nm檢測(cè)通道）、1mL玻璃比色皿、恒溫水浴鍋
IFCC推薦方法：紫外分光光度計(jì)（340nm檢測(cè)通道）、1cm石英比色皿、半自動(dòng)生化分析儀
ELISA法：酶標(biāo)儀（450nm檢測(cè)通道）、96孔板、洗板機(jī)
通用：電子天平、離心機(jī)、可調(diào)式移液器、漩渦混勻器
必備耗材
離心管（1.5mL/10mL）、一次性吸頭、比色管、試管架
自備試劑：蒸餾水/去離子水、生理鹽水
樣本前處理方法
血清/血漿樣本采集：空腹采集靜脈血，分離血清/血漿保存：4℃可保存3天，-20℃可保存1個(gè)月溶血處理：若樣本溶血，需重新采集樣本，避免紅細(xì)胞中ALT干擾測(cè)定
組織/細(xì)胞樣本組織處理：稱取0.1g組織，加入1mL生理鹽水，冰浴勻漿細(xì)胞處理：收集1×10?細(xì)胞，加入1mL生理鹽水，冰浴超聲波破碎離心：10000g 4℃離心15min，取上清液置冰上待測(cè)
尿液/腦脊液樣本采集：收集晨尿或隨機(jī)尿，腦脊液樣本需無(wú)菌采集稀釋：用生理鹽水稀釋10-20倍后測(cè)定保存：4℃可保存24h，-20℃可保存1個(gè)月
測(cè)定操作步驟
賴氏法操作儀器預(yù)熱：分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至505nm，蒸餾水調(diào)零樣本測(cè)定：
取比色管，加入0.1mL樣本 + 0.5mL試劑一，37℃水浴30min
加入0.5mL試劑二，混勻，37℃水浴20min
加入5.0mL試劑三，混勻，室溫放置10min
測(cè)定505nm波長(zhǎng)下的吸光度空白對(duì)照：取0.1mL生理鹽水替代樣本，同樣處理標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成0、20、40、80、120、200U/L系列濃度，同樣處理
IFCC推薦方法操作儀器預(yù)熱：分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至340nm，蒸餾水調(diào)零樣本測(cè)定：
在石英比色皿中加入2.0mL試劑一 + 0.1mL樣本，37℃預(yù)溫5min
加入0.5mL試劑二，立即混勻，記錄340nm處30s、1min、2min、3min的吸光度
計(jì)算吸光度下降速率（ΔA/min）空白對(duì)照：取0.1mL生理鹽水替代樣本，同樣處理標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成0、20、40、80、120、200U/L系列濃度，同樣處理
ELISA法操作包被板準(zhǔn)備：從試劑盒中取出包被板，平衡至室溫樣本與標(biāo)準(zhǔn)品加樣：分別加入50μL樣本和標(biāo)準(zhǔn)品至對(duì)應(yīng)孔中，37℃孵育30min洗滌：棄去孔內(nèi)液體，用洗滌液洗滌3次，每次浸泡3min酶標(biāo)抗體加樣：加入50μL酶標(biāo)抗體至每孔，37℃孵育30min洗滌：棄去孔內(nèi)液體，用洗滌液洗滌5次，每次浸泡3min底物顯色：加入50μL底物液至每孔，37℃避光孵育15min終止反應(yīng)：加入50μL終止液至每孔，立即讀取450nm波長(zhǎng)下的吸光度
結(jié)果計(jì)算方法
單位定義
U/L：每升樣本中每分鐘催化生成1μmol丙酮酸的酶量
U/g 鮮重：每克鮮重樣本每分鐘催化生成1μmol丙酮酸的酶量
賴氏法計(jì)算公式
ALT活性(U/L)=(A測(cè)定?A空白)×C標(biāo)(A標(biāo)準(zhǔn)?A空白)ALT活性(U/L)=(A標(biāo)準(zhǔn)?A空白)(A測(cè)定?A空白)×C標(biāo)
A測(cè)定：樣本管吸光度值
A空白：空白管吸光度值
A標(biāo)準(zhǔn)：標(biāo)準(zhǔn)管吸光度值
C標(biāo)：標(biāo)準(zhǔn)品濃度（U/L）
IFCC推薦方法計(jì)算公式
ALT活性(U/L)=ΔA/min×V總×106ε×d×V樣ALT活性(U/L)=ε×d×V樣ΔA/min×V總×106
ΔA/min：340nm處吸光度下降速率
V總：反應(yīng)體系總體積（mL）
ε：NADH摩爾消光系數(shù)（6.22×103 L/mol/cm）
d：比色皿光徑（cm）
V樣：樣本體積（mL）
ELISA法計(jì)算公式
ALT活性(U/L)=(A測(cè)定?A空白)×C標(biāo)(A標(biāo)準(zhǔn)?A空白)ALT活性(U/L)=(A標(biāo)準(zhǔn)?A空白)(A測(cè)定?A空白)×C標(biāo)
A測(cè)定：樣本孔吸光度值
A空白：空白孔吸光度值
A標(biāo)準(zhǔn)：標(biāo)準(zhǔn)孔吸光度值
C標(biāo)：標(biāo)準(zhǔn)品濃度（U/L）
性能指標(biāo)
指標(biāo) 賴氏法 IFCC推薦方法 ELISA法
線性范圍 0~200U/L 0~1000U/L 0~400U/L
最低檢測(cè)限 ≤5U/L ≤5U/L ≤2U/L
回收率 90%~110% 95%~105% 90%~110%
批內(nèi)精密度 CV≤8.0% CV≤5.0% CV≤5.0%
批間精密度 CV≤10.0% CV≤8.0% CV≤8.0%
穩(wěn)定性 2-8℃保存12個(gè)月 2-8℃保存12個(gè)月 2-8℃保存12個(gè)月
注意事項(xiàng)
樣本處理：
樣本需避免溶血和脂血，避免紅細(xì)胞中ALT干擾測(cè)定
組織樣本需新鮮制備，避免ALT失活
尿液樣本需離心去除沉淀后測(cè)定
試劑使用：
賴氏法試劑需現(xiàn)配現(xiàn)用，避免2,4-二硝基苯肼分解失效
IFCC推薦方法試劑需避免反復(fù)凍融，用后立即放回2-8℃保存
不同批號(hào)試劑不能混用，需重新繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線
測(cè)定過(guò)程：
賴氏法反應(yīng)溫度需嚴(yán)格控制在37℃，反應(yīng)時(shí)間30分鐘
IFCC推薦方法需嚴(yán)格控制預(yù)溫時(shí)間和讀數(shù)時(shí)間
若吸光度值超出線性范圍，需稀釋樣本后重新測(cè)定
質(zhì)量控制：
每次實(shí)驗(yàn)需設(shè)置空白對(duì)照和質(zhì)控樣本
定期校準(zhǔn)儀器，確保檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性
若結(jié)果偏差較大，需檢查試劑是否變質(zhì)或樣本處理是否正確
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關(guān)鍵字： 谷丙轉(zhuǎn)氨酶/丙氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶;GPT/ALT;測(cè)試盒;
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