谷胱甘肽還原酶（GR）活性測定試劑盒說明書
微量法 100T/96S
正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定
測定意義：
GR是廣泛存在于真核和原核生物中的一種黃素蛋白氧化還原酶，是谷胱甘肽氧化還原循環(huán)的關(guān)鍵酶之一（通常昆蟲中GR被TrxR取代）。GR催化NADPH還原GSSG生成GSH，有助于維持體內(nèi)GSH/GSSG比值。GR在氧化脅迫反應(yīng)中對活性氧清除起關(guān)鍵作用，此外GR還參與抗壞血酸－谷胱甘肽循環(huán)途徑。
測定原理：
GR能催化NADPH還原GSSG再生GSH，同時NADPH脫氫生成NADP+；NADPH在340 nm有特征吸收峰，相反NADP+在該波長無吸收峰；通過測定340 nm吸光度下降速率來測定NADPH脫氫速率，從而計算GR活性。
組成：
產(chǎn)品名稱 | GSH012-100T/96S | Storage |
試劑一：液體 | 120ml | 4℃ |
試劑二：粉劑 | 2支 | -20℃ |
試劑三：粉劑 | 2支 | -20℃ |
說明書 | 一份 |
試劑二：粉劑×2支，-20℃保存。臨用前加入1.2ml蒸餾水，混勻。
試劑三：粉劑×2支，-20℃保存。臨用前加入0.6ml蒸餾水，混勻。
自備儀器和用品：
低溫離心機、水浴鍋、移液器、紫外分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板、和蒸餾水
粗酶液提?。?/span>
組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(ml)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1ml試劑一）進行冰浴勻漿。8000g，4℃離心15min，取上清，置冰上待測。
細菌、真菌：按照細胞數(shù)量（104個）：試劑一體積（ml）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞加入1ml試劑一），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；然后8000g，4℃，離心15min，取上清置于冰上待測。
血清等液體：直接測定。
操作步驟：
1. 分光光度計/酶標儀預(yù)熱30 min，調(diào)節(jié)波長到340 nm，蒸餾水調(diào)零。
2. 試劑一置于25℃（普通物質(zhì)）或者37℃（哺乳動物）中預(yù)熱30min。
3. 測定管：取微量石英比色皿或96孔板，依次加入10μl試劑三，20μl試劑二，150μl試劑一，20μl上清液，混勻，于340nm迅速測定初始吸光度和180 s吸光度，記為A測1和A測2，△A測定管= A測1﹣A測2。
注意：
1、加完上清液后必須迅速混勻測定，保證準確測出初始反應(yīng)速度；
2、當(dāng)出現(xiàn)初始180s內(nèi)吸光值不穩(wěn)定時，可以適當(dāng)延長反應(yīng)時間，選取相對穩(wěn)定的時間段內(nèi)吸光值變化值；
3、當(dāng)所測△A測定管的值在零點附近徘徊時，可能原因：（1）樣本GR酶活性低，建議濃縮樣本后再進行測定；（2）樣本GR酶活性過高，吸光值變化區(qū)間過小無法準確測出，建議樣本稀釋2~5倍后再進行測定
計算公式：
a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下
(1). 按蛋白濃度計算
活性單位定義：在一定溫度中，pH8.0條件下，每毫克蛋白每分鐘催化1nmol NADPH氧化為1個酶活單位。
GR酶活(nmol/min/mg prot)= [ △A測定管÷ε÷d×V反總×109]÷[Cpr×V樣]÷T
= 536×△A測定管÷Cpr
(2). 按樣本質(zhì)量計算
活性單位定義：在一定溫度中，pH8.0條件下，每克樣本每分鐘催化1nmol NADPH氧化為1個酶活單位。
GR酶活(nmol/min/g 鮮重)= [ △A測定管÷ε÷d×V反總×109] ÷(W×V樣÷V樣總)÷T
= 536×△A測定管÷W
(3) 按細胞數(shù)量計算
活性單位定義：在一定溫度中，pH8.0條件下，每104個細胞每分鐘催化1nmol NADPH氧化為1個酶活單位。
GR酶活(nmol/min/104 cell)= [ △A測定管÷ε÷d×V反總×109] ÷(細胞數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T
= 536×△A測定管÷細胞數(shù)量
（4）按液體體積計算
活性單位定義：在一定溫度中，pH8.0條件下，每毫升液體每分鐘催化1nmol NADPH氧化為1個酶活單位。
GR酶活(nmol/min/ml)= [ △A測定管÷ε÷d×V反總×109]÷×V樣÷T
= 536×△A測定管
ε：NADPH摩爾消光系數(shù)6.22×103L/mol/cm；d：比色皿光徑，1 cm；V反總：反應(yīng)體系總體積，200μl=2×10-4 L；106：1 mol=1×106μmol； Cpr：上清液蛋白濃度（mg/ml）；W ：樣品質(zhì)量；V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，20μl =2×10-2 ml；V樣總：提取液體積，1 ml；V樣總：提取液體積，1 ml；T：反應(yīng)時間，3 min。
b.使用96孔板測定的計算公式如下
(1). 按蛋白濃度計算
活性單位定義：在一定溫度中，pH8.0條件下，每毫克蛋白每分鐘催化1nmol NADPH氧化為1個酶活單位。
GR酶活(nmol/min/mg prot)= [ △A測定管÷ε÷d×V反總×109]÷[Cpr×V樣]÷T
= 1072×△A測定管÷Cpr
(2). 按樣本質(zhì)量計算
活性單位定義：在一定溫度中，pH8.0條件下，每克樣本每分鐘催化1nmol NADPH氧化為1個酶活單位。
GR酶活(nmol/min/g 鮮重)= [ △A測定管÷ε÷d×V反總×109] ÷(W×V樣÷V樣總)÷T
= 1072×△A測定管÷W
(3) 按細胞數(shù)量計算
活性單位定義：在一定溫度中，pH8.0條件下，每104個細胞每分鐘催化1nmol NADPH氧化為1個酶活單位。
GR酶活(nmol/min/104 cell)= [ △A測定管÷ε÷d×V反總×109] ÷(細胞數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T
=1072×△A測定管÷細胞數(shù)量
（4）按液體體積計算
活性單位定義：在一定溫度中，pH8.0條件下，每毫升液體每分鐘催化1nmol NADPH氧化為1個酶活單位。
GR酶活(nmol/min/ml)= [ (△A測定管÷ε÷d×V反總×109]÷×V樣÷T
=1072×△A測定管
ε：NADPH摩爾消光系數(shù)6.22×103L/mol/cm；d：96孔板光徑，0.5 cm；V反總：反應(yīng)體系總體積，200μl=2×10-4 L；106：1 mol=1×106μmol； Cpr：上清液蛋白濃度（mg/ml）；W ：樣品質(zhì)量；V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，20μl =2×10-2 ml；V樣總：提取液體積，1 ml；V樣總：提取液體積，1 ml；T：反應(yīng)時間，3 min。
注意事項：
（1）樣品處理等過程均需要在冰上進行，且須在當(dāng)日測定酶活力，勻漿液避免反復(fù)凍融；
（2）試劑二和試劑三須現(xiàn)配現(xiàn)用，配制完后，置于冰上，未使用完的4℃保存，三天內(nèi)使用完。
（3）測定前須先用1～2個樣做預(yù)實驗，哺乳動物組織一般須用試劑一稀釋2～5倍。
（4）細胞中GR活性測定時，細胞數(shù)目須在300萬-500萬之間，細胞中GR的提取時可加試劑一后研磨或超聲波處理，不能用細胞裂解液處理細胞。
關(guān)鍵字： 谷胱甘肽還原酶;谷胱甘肽還原酶(GR)檢測試劑盒;
伊勢久（江蘇連云港）生物科技有限責(zé)任公司，成立于2019年，坐落于新亞歐大陸橋東方橋頭堡連云港市。公司由資深行業(yè)專家和雙一流高校博士聯(lián)合創(chuàng)辦，主要從事生化檢測、病理檢測和原料酶等相關(guān)試劑的研發(fā)和生產(chǎn)。
我司位于聯(lián)東U谷科技創(chuàng)新谷內(nèi)的2000平米的生產(chǎn)、研發(fā)基地已建成投入運行，其中包括150平米的超十萬級的潔凈車間。我司堅持以自主研發(fā)為核心，現(xiàn)已生產(chǎn)出的脲酶、tRNA轉(zhuǎn)運核糖核酸、刀豆球蛋白、胰蛋白酶抑制劑等產(chǎn)品，熱銷市場以來收到了客戶的廣泛好評。
公司秉承“ 摯誠科研、匠心傳承” 的發(fā)展理念，聚焦于前沿生物技術(shù)的應(yīng)用和創(chuàng)新，努力成為生物科技領(lǐng)域的標桿企業(yè)。堅持以客戶為中心，致力于為中國的科研工作者提供高品質(zhì)的產(chǎn)品和專業(yè)服務(wù)，始終是我們努力的目標和方向。