禽傳染性喉氣管炎熒光PCR檢測(cè)試劑盒（實(shí)時(shí)熒光PCR法）
使用說明書
【產(chǎn)品名稱】
通用名稱：禽傳染性喉氣管炎熒光PCR檢測(cè)試劑盒（實(shí)時(shí)熒光PCR法）
英文名稱：Infectious Laryngotracheitis virus Detection Kit (Real-Time PCR Method)
【包裝規(guī)格】50T/盒
【預(yù)期用途】
本試劑盒適用于禽傳染性喉氣管炎病毒檢測(cè)，可用于臨床禽傳染性喉氣管炎病毒感染的輔助診斷，但不作確診使用。
【原 理】
本試劑盒針對(duì)禽傳染性喉氣管炎病毒基因組高度保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物和探針，在反應(yīng)體系中含傳染性喉氣管炎基因組模板的情況下，PCR反應(yīng)得以進(jìn)行并釋放熒光信號(hào)。利用熒光定量PCR儀對(duì)PCR過程中相應(yīng)通道信號(hào)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和輸出，實(shí)現(xiàn)檢測(cè)結(jié)果的定性分析。
【試劑盒組成】
序號(hào) | 組成 | 50T/盒 |
1 | ILTV PCR反應(yīng)液 | 1000 μL×1管 |
2 | ILTV 陽性對(duì)照 | 40 μL×1管 |
3 | ILTV 陰性對(duì)照 | 40 μL×1管 |
4 | 說明書 | 1份 |
注：陰性對(duì)照為滅菌純水，陽性對(duì)照為含禽傳染性喉氣管炎靶基因的質(zhì)粒。
【儲(chǔ)存條件及有效期】避光-20℃以下保存，避免反復(fù)凍融，有效期12個(gè)月。
【適用儀器】ABI 系列、Bio-Rad系列、Agilent Stratagene MX系列 、Roche LightCycler R480、Cepheid SmartCycler、Rotor-Gene系列、杭州博日系列等多通道實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。
【樣本要求】
1.待檢活雞或死雞，用棉拭子取氣呼吸道分泌物，置于 50%甘油生理鹽水中。
2.病死或撲殺雞，取氣管、肺、腎、輸卵管等組織，取少量樣品（2～3克）于研缽或勻漿器中研磨，然后將研磨勻漿轉(zhuǎn)入無菌離心管中，3000rpm/min 離心10分鐘取上清待檢。
3.應(yīng)避免標(biāo)本間交叉污染。
4.標(biāo)本收集后可立即檢測(cè)；若不能立即檢測(cè)，可置于2～8℃冷藏過夜保存；如需長(zhǎng)期保存，標(biāo)本應(yīng)凍存于-80℃以下，避免反復(fù)凍融。
【檢驗(yàn)方法】
1. 試劑準(zhǔn)備（試劑準(zhǔn)備區(qū)）
（1）從冰箱中取出試劑盒, 從試劑盒中取出實(shí)驗(yàn)所需試劑,充分融化混勻并瞬時(shí)離心以去除管壁附著液體。
（2）核算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需要的反應(yīng)數(shù)（n），并根據(jù)如下表所示反應(yīng)體系計(jì)算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需要的各種試劑量。
n =陰性對(duì)照數(shù)（1T）+陽性對(duì)照數(shù)（1T）+誤差預(yù)留量（1T）+樣本數(shù)
單反液配制表(每份) | PCR反應(yīng)液（UNG酶及Taq酶） | 20 μL |
（3）在無菌離心管中加入上述試劑，充分混勻后瞬時(shí)離心。按照20 μL/管分裝量將試劑分裝至PCR反應(yīng)管。
2.樣本準(zhǔn)備（樣本處理區(qū)）
用QIAGEN、Roche公司RNA提取試劑盒提取RNA，具體操作按照其試劑盒說明書操作。
3.加樣
在上述制備好的PCR反應(yīng)樣本管中分別加入處理好的待測(cè)標(biāo)本RNA各5 μl、終體積25 μl/管，蓋好PCR反應(yīng)蓋混勻后瞬時(shí)低速離心，轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。陰性對(duì)照和陽性對(duì)照管則各加5 μL試劑盒自帶的陰性對(duì)照或陽性對(duì)照品，終體積為25 μl/管，蓋好PCR反應(yīng)蓋混勻后瞬時(shí)低速離心，轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。
4. PCR（PCR擴(kuò)增區(qū)）
（1）取樣本處理區(qū)準(zhǔn)備好的PCR反應(yīng)管，放置在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀樣品槽相應(yīng)位置，并記錄放置順序。（2）按下表設(shè)置儀器核酸擴(kuò)增相關(guān)參數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
反應(yīng)體積 | 25 μL | 通道選擇 | FAM通道采集 ILTV 熒光信號(hào) |
PCR 反應(yīng) 條件 | 步驟 | 條件 | 循環(huán)數(shù) |
UNG處理 | 37℃：2分鐘（min） | 1 |
預(yù)變性 | 95℃：3分鐘（min） | 1 |
PCR擴(kuò)增 | 95℃：5秒（s） | 40 |
55℃：40秒（s） （此階段結(jié)束時(shí)采集熒光信號(hào)） |
注：ABI系列熒光PCR儀在設(shè)置時(shí)不選ROX校正，設(shè)置淬滅基團(tuán)選擇None。
【參考值（參考范圍）】
1.試劑盒有效性判定：
（1）陽性對(duì)照：有典型S型擴(kuò)增曲線或Ct值≤35。
（2）陰性對(duì)照：Ct值＞38或無Ct值，線形為直線或輕微斜線，無指數(shù)增長(zhǎng)期。
2.標(biāo)本結(jié)果判定：
（1）陽性：標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果Ct值≤35或有明顯指數(shù)增長(zhǎng)期。
（2）可疑：標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果Ct值在35～38范圍內(nèi)。此時(shí)應(yīng)對(duì)標(biāo)本進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)，如重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果Ct值仍在35～38范圍內(nèi)，有明顯指數(shù)增長(zhǎng)期，則判定為陽性，否則為陰性。
（3）陰性：標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果Ct值＞38或無Ct值。
【檢驗(yàn)結(jié)果的解釋】
通道及檢測(cè)結(jié)果 | 標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果解釋 |
FAM |
+ | 標(biāo)本中檢出ILTV |
- | 標(biāo)本中未檢出ILTV |
【檢驗(yàn)方法的局限性】
1. 當(dāng)檢測(cè)樣本中被檢核酸濃度低于本試劑盒的最低檢出限時(shí)可能會(huì)發(fā)生假陰性的結(jié)果。
2. 被檢樣本在采集、運(yùn)輸、儲(chǔ)存以及處理過程中操作方式不當(dāng)容易造成RNA降解而產(chǎn)生假陰性結(jié)果。
3. 樣本在采集、運(yùn)輸、儲(chǔ)存以及處理過程中發(fā)生交叉污染，則容易得到假陽性結(jié)果。
【產(chǎn)品性能指標(biāo)】 產(chǎn)品的最低檢出限為103 Copies/mL，產(chǎn)品CV值≤3%。
【注意事項(xiàng)】
1. 使用本試劑盒的實(shí)驗(yàn)室，應(yīng)嚴(yán)格按照國(guó)家有關(guān)部分頒布的有關(guān)基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理規(guī)范進(jìn)行管理；
2. 為避免RNA降解，樣本處理過程應(yīng)在0-4℃條件下操作，且完成實(shí)驗(yàn)后立即上機(jī)檢測(cè)；樣本處理過程中使用的器具耗材應(yīng)經(jīng)過無核酶處理；
3. 各區(qū)域物品均為專用，不得交叉使用，以免污染；檢測(cè)結(jié)束后，應(yīng)立即對(duì)工作臺(tái)清潔；
4. 吸取反應(yīng)液時(shí)，應(yīng)盡量避免產(chǎn)生氣泡；上 PCR 儀前，應(yīng)注意檢查各反應(yīng)管是否蓋緊，以免液體蒸發(fā)造成結(jié)果不準(zhǔn)確；
5. 試劑盒所有試劑在使用前應(yīng)該在常溫下充分融化混勻，并應(yīng)瞬時(shí)離心；
6. 試劑盒內(nèi)所配陰性和陽性對(duì)照在第一次使用前應(yīng)全部轉(zhuǎn)移至標(biāo)本準(zhǔn)備區(qū)，并單獨(dú)存放；
7. 為防止熒光干擾，應(yīng)避免裸手直接接觸PCR反應(yīng)管，并應(yīng)避免在PCR反應(yīng)管上進(jìn)行任何標(biāo)記；
8. 檢測(cè)過程中使用過的吸頭，應(yīng)直接打到盛有 10%次氯酸的廢物缸內(nèi)，檢測(cè)結(jié)束的PCR 反應(yīng)管，切忌開蓋，并與其他廢棄物品一同滅菌后丟棄；工作臺(tái)及各種實(shí)驗(yàn)用品應(yīng)定期用 10%次氯酸、75%酒精或紫外燈進(jìn)行消毒；
9. 儀器擴(kuò)增相關(guān)參數(shù)應(yīng)按照本說明書相關(guān)要求進(jìn)行設(shè)置；不同批號(hào)試劑不能混用；并在有效期內(nèi)使用。
關(guān)鍵字： 禽傳染性喉氣管炎熒光PCR檢測(cè)試劑盒;禽傳染性喉氣管炎熒光PCR檢測(cè)試劑盒;PCR熒光蛋白試劑盒;實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)法;雅吉PCR試劑盒;
上海雅吉生物科技的核心業(yè)務(wù)主要圍繞生命科學(xué)研究所需的各類試劑、細(xì)胞、抗體及技術(shù)服務(wù)展開，具體可歸納為以下幾個(gè)方面：
細(xì)胞產(chǎn)品與技術(shù)平臺(tái)：
細(xì)胞產(chǎn)品：提供包括正常細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、腫瘤耐藥細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞系。同時(shí)，公司也是美國(guó)ScienCell等品牌的原代細(xì)胞產(chǎn)品的代理商。
穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株構(gòu)建服務(wù)：公司具備豐富的蛋白表達(dá)研究經(jīng)驗(yàn)，能夠?yàn)榭蛻籼峁幕蛐蛄械椒€(wěn)定細(xì)胞株交付的一站式定制服務(wù)，應(yīng)用于基因功能研究、藥物篩選和重組蛋白生產(chǎn)等領(lǐng)域。
科研試劑：這是公司的基礎(chǔ)和優(yōu)勢(shì)業(yè)務(wù)。產(chǎn)品線全面覆蓋了分子生物學(xué)、免疫學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和微生物學(xué)等多個(gè)學(xué)科。
ELISA試劑盒：提供人、大鼠、小鼠、犬、魚、雞、牛等多種物種以及植物的ELISA檢測(cè)試劑盒，在國(guó)內(nèi)眾多重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室中廣泛使用并被科研文獻(xiàn)引用。生化試劑、抗體與血清：提供包括一抗、二抗、單克隆/多克隆抗體在內(nèi)的多種抗體產(chǎn)品，以及胎牛血清等細(xì)胞培養(yǎng)用血清。
蛋白研究相關(guān)試劑盒：提供超過300種針對(duì)不同樣本來源（動(dòng)物、植物、微生物）和不同細(xì)胞器（如線粒體、外泌體）的蛋白提取及檢測(cè)試劑盒。