馬傳貧熒光PCR檢測試劑盒（實時熒光PCR法）
使用說明書
【產(chǎn)品名稱】
通用名稱：馬傳貧熒光PCR檢測試劑盒（實時熒光PCR法）
英文名稱：Equine Infectious Anemia Virus Detection Kit (Real-Time PCR Method)
【包裝規(guī)格】50T/盒
馬傳染性貧血病簡稱馬傳貧(EIA),由反錄病毒科慢病毒亞科中的馬傳染性貧血病病毒引起的馬、騾、驢傳染病。本試劑盒適用于定性檢測馬傳染性貧血病病毒，不進行病毒分型，可用于EIAV感染的輔助診斷，但不作確診使用。
【原 理】
本試劑盒針對手EIAV高度保守區(qū)域設計特異性引物和探針，在反應體系中含EIAV基因組模板的情況下，PCR反應得以進行并釋放熒光信號。利用熒光定量PCR儀對PCR過程中相應通道信號進行實時監(jiān)測和輸出，實現(xiàn)檢測結果的定性分析。
【試劑盒組成】
序號 | 組成 | 50T/盒 |
1 | EIAV RT-PCR反應液 | 875 μL×1管 |
2 | EIAV 混合酶液 | 125 μL×1管 |
3 | EIAV 陽性對照 | 40 μL×1管 |
4 | EIAV 陰性對照 | 40 μL×1管 |
5 | 說明書 | 1份 |
注：陰性對照為滅菌純水，陽性對照為含EIAV靶基因的質粒。
【儲存條件及有效期】避光-20℃以下保存，避免反復凍融，有效期12個月。
【適用儀器】ABI 系列、Bio-Rad系列、Agilent Stratagene MX系列、Roche LightCycler 480、Cepheid SmartCycler、Rotor-Gene系列、杭州博日系列等多通道實時熒光定量PCR儀。
【樣本要求】
1.樣本為血液和臟器（肝、脾、骨髓、淋巴結等）。
2.樣本采集后應立即檢測，若不能立即檢測，應置于-80℃冷凍保存，避免反復凍融，用干冰或液氮運輸。
【檢驗方法】
1. 試劑準備（試劑準備區(qū)）
（1）從冰箱中取出試劑盒, 從試劑盒中取出實驗所需試劑，充分融化混勻并瞬時離心以去除管壁附著液體。
（2）核算當次實驗所需要的反應數(shù)（n），并根據(jù)如下表所示反應體系計算當次實驗所需要的各種試劑量。
n =陰性對照數(shù)（1T）+陽性對照數(shù)（1T）+誤差預留量（1T）+樣本數(shù)
單反液配制表(每份) | RT-PCR反應液 | 17.5μL |
混合酶液 | 2.5 μL |
（3）在無菌離心管中加入上述試劑，充分混勻后瞬時離心。按照20 μL/管分裝量將試劑分裝至PCR反應管。
2.樣本準備（樣本處理區(qū)）
用QIAGEN、Roche公司RNA提取試劑盒提取RNA，具體操作按照其試劑盒說明書操作。
3.加樣
在上述制備好的PCR反應管中分別加入處理好的待測標本RNA各5μl、終體積25μl/管，蓋好PCR反應蓋混勻后瞬時低速離心，轉移到PCR儀器上。
根據(jù)需要，在上述準備好的PCR反應管中分別加入陰性對照品以及陽性對照品各5μl，終體積為25μl/管，蓋好PCR反應蓋混勻后瞬時低速離心，轉移到PCR儀器上。
4. PCR（PCR擴增區(qū)）
（1）取樣本處理區(qū)準備好的PCR反應管，放置在實時熒光定量PCR儀樣品槽相應位置，并記錄放置順序。
（2）按下表設置儀器核酸擴增相關參數(shù)進行PCR擴增。
反應體積 | 25 μL | 通道選擇 | FAM通道采集 EIAV熒光信號 |
PCR 反應 條件 | 步驟 | 條件 | 循環(huán)數(shù) |
反轉錄 | 50℃：10分鐘（min） | 1 |
預變性 | 95℃：3分鐘（min） | 1 |
PCR擴增 | 95℃：5秒（s） | 40 |
55℃：40秒（s） （此階段結束時采集熒光信號） |
注：ABI系列熒光PCR儀在設置時不選ROX校正，設置淬滅基團選擇None。
【參考值（參考范圍）】
1.試劑盒有效性判定：
（1）陽性對照：有典型S型擴增曲線或Ct值≤35。
（2）陰性對照：Ct值＞38或無Ct值，線形為直線或輕微斜線，無指數(shù)增長期。
2.標本結果判定：
（1）陽性：標本檢測結果Ct值≤35或有明顯指數(shù)增長期。
（2）可疑：標本檢測結果Ct值在35～38范圍內(nèi)。此時應對標本進行重復檢測，如重復實驗結果Ct值仍在35～38范圍內(nèi)，有明顯指數(shù)增長期，則判定為陽性，否則為陰性。
（3）陰性：標本檢測結果Ct值＞38或無Ct值。
【檢驗結果的解釋】
通道及檢測結果 | 標本檢測結果解釋 |
FAM |
+ | 標本中檢出EIAV RNA |
- | 標本中未檢出EIAV RNA |
【檢驗方法的局限性】
1. 當檢測樣本中被檢核酸濃度低于本試劑盒的最低檢出限時可能會發(fā)生假陰性的結果。
2. 被檢樣本在采集、運輸、儲存以及處理過程中操作方式不當容易造成RNA降解而產(chǎn)生假陰性結果。
3. 樣本在采集、運輸、儲存以及處理過程中發(fā)生交叉污染，則容易得到假陽性結果。
【產(chǎn)品性能指標】 產(chǎn)品的最低檢出限為103 Copies/mL，產(chǎn)品CV值≤3%。
【注意事項】
1. 使用本試劑盒的實驗室，應嚴格按照國家有關部分頒布的有關基因擴增檢驗實驗室管理規(guī)范進行管理；
2. 為避免RNA降解，樣本處理過程應在0-4℃條件下操作，且完成實驗后立即上機檢測；樣本處理過程中使用的器具耗材應經(jīng)過無核酶處理；
3. 各區(qū)域物品均為專用，不得交叉使用，以免污染；檢測結束后，應立即對工作臺清潔；
4. 吸取反應液時，應盡量避免產(chǎn)生氣泡；上 PCR 儀前，應注意檢查各反應管是否蓋緊，以免液體蒸發(fā)造成結果不準確；
5. 試劑盒所有試劑在使用前應該在常溫下充分融化混勻，并應瞬時離心；
6. 試劑盒內(nèi)所配陰性和陽性對照在第一次使用前應全部轉移至標本準備區(qū)，并單獨存放；
7. 為防止熒光干擾，應避免裸手直接接觸PCR反應管，并應避免在PCR反應管上進行任何標記；
8. 檢測過程中使用過的吸頭，應直接打到盛有 10%次氯酸的廢物缸內(nèi)，檢測結束的PCR 反應管，切忌開蓋，并與其他廢棄物品一同滅菌后丟棄；工作臺及各種實驗用品應定期用 10%次氯酸、75%酒精或紫外燈進行消毒；
9. 儀器擴增相關參數(shù)應按照本說明書相關要求進行設置；不同批號試劑不能混用；并在有效期內(nèi)使用。
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上海雅吉生物科技的核心業(yè)務主要圍繞生命科學研究所需的各類試劑、細胞、抗體及技術服務展開，具體可歸納為以下幾個方面：
細胞產(chǎn)品與技術平臺：
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