(PVB19)細(xì)小病毒B19探針法熒光定量PCR試劑盒使用方法
一、DNA 提取(樣本制備區(qū))
1. （選做）如果有 N 個(gè)樣品待提取，最好設(shè)置 N+2 個(gè)提取，多出的是 PC（樣品制備陽(yáng)性對(duì)照）和 NC（樣品制備陰性對(duì)照）。可以取陽(yáng)性對(duì)照的 1000 倍稀釋液 10μL 再加上一定量的水，使總體積與待提取樣品的規(guī)定體積一致，以此作為 PC。另外用水作為NC。
2. 用自選方法提取純化樣品 DNA，本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù)核酸提取試劑盒兼容。建議使用病毒基因組 DNA 提取試劑盒（Cat: GZ010701-50）提取 DNA
二、稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品(樣本制備區(qū))
（由于陽(yáng)性對(duì)照濃度高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，避免污染樣品或本試劑盒的其他成分）。
1. 標(biāo)記 6 個(gè)離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。
2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光模板稀釋液，（最好用帶芯槍頭，下同）。
3. 在 7 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(試劑盒提供)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
4. 換槍頭，在 6 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
5. 換槍頭，在 5 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
6. 重復(fù)上面的操作直到得到 6 個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。若無需制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，將陽(yáng)性對(duì)照稀釋到 1×10E5 拷貝/μL 即可。
(PVB19)細(xì)小病毒B19探針法熒光定量PCR試劑盒結(jié)果分析
1. 如果制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，則以陽(yáng)性對(duì)照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測(cè)樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品 DNA 濃度的 log 值，推算出其濃度。
2. 如果未制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，按照如下標(biāo)準(zhǔn)判定結(jié)果：
陽(yáng)性對(duì)照（1×10E5 拷貝/μL）結(jié)果：Ct 值<30，有明顯指數(shù)增長(zhǎng)，呈典型的 S 型曲線。
陰性對(duì)照結(jié)果：Ct 值>40 或無 Ct 值，無明顯指數(shù)增長(zhǎng)期和平臺(tái)期。
樣本檢測(cè)結(jié)果：Ct 值<38，有明顯指數(shù)增長(zhǎng)，表明樣本中檢測(cè)出細(xì)小病毒 B19，
結(jié)果為陽(yáng)性；Ct 值>40 或無 Ct 值，表明樣本中未檢測(cè)出細(xì)小病毒 B19，
結(jié)果為陰性；Ct值在 38-40 范圍，應(yīng)對(duì)樣本進(jìn)行復(fù)檢，
如重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果 Ct 值仍在 38-40 范圍，有明顯指數(shù)增長(zhǎng)，則判定為陽(yáng)性，否則為陰性。