大鼠酪氨酸3/色氨酸5單加氧酶活化蛋白θ(YWHAq)重組蛋白適用于 14-3-3 蛋白互作篩選、激酶信號(hào)調(diào)控、細(xì)胞周期及凋亡通路分子機(jī)制研究實(shí)驗(yàn)。
型號(hào)：YS-DB2020
產(chǎn)品名稱(chēng)：大鼠酪氨酸3/色氨酸5單加氧酶活化蛋白θ(YWHAq)重組蛋白
物種：Homo sapiens (Human，人), Mus musculus (Mouse，小鼠), Rattus norvegicus (Rat，大鼠)
英文名稱(chēng)：Recombinant Tyrosine 3/Tryptophan 5 Monooxygenase Activation Protein Theta (YWHAq)
HS1; 14-3-3; 1C5; Protein HS1; 14-3-3 protein T-cell; 14-3-3 protein tau
酶與激酶
物種：Homo sapiens (Human，人), Mus musculus (Mouse，小鼠), Rattus norvegicus (Rat，大鼠)
來(lái)源：原核表達(dá)
宿主E.coli
內(nèi)毒素水平：<1.0EU/μg(LAL法測(cè)定)
亞細(xì)胞定位：：n/a
預(yù)測(cè)分子量：-
實(shí)際分子量：-(差異分析請(qǐng)參閱說(shuō)明書(shū))
片段與標(biāo)簽：N-terminal His Tag
緩沖液成份：磷酸鹽緩沖液（pH7.4，含有 0.01% SKL, 1mM DTT, 5% Trehalose和Proclin300.）
性狀：凍干粉
純度：> 97%
等電點(diǎn)：-
應(yīng)用：Positive Control; Immunogen; SDS-PAGE; WB.
規(guī)格：10μg、50μg、200μg、1mg、5mg
檢測(cè)原理：
SDS-PAGE 純度分析：電泳分離蛋白，染色統(tǒng)計(jì)主條帶純度，判斷雜蛋白與蛋白降解。
BCA 比色定量：蛋白還原二價(jià)銅顯色，吸光度線性定量重組蛋白濃度。
WB 特異性鑒定：YWHAq 特異性抗體特異性結(jié)合重組蛋白，驗(yàn)證蛋白表達(dá)無(wú)誤。
蛋白互作結(jié)合活性檢測(cè)：體外結(jié)合磷酸化靶蛋白，免疫共沉淀驗(yàn)證結(jié)合能力，表征分子伴侶生物學(xué)功能。
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使用方法：
1. 蛋白復(fù)溶
解凍：從低溫冰箱取出蛋白后，立即置于冰上緩慢解凍，避免室溫放置導(dǎo)致蛋白變性。
緩沖液選擇：根據(jù)蛋白特性選擇合適的復(fù)溶緩沖液，常用基礎(chǔ)緩沖液為10-50mM Tris-HCl（pH7.0-8.0）或PBS（pH7.2-7.4）；部分蛋白需添加100-300mM NaCl維持滲透壓，或添加1-5mM DTT、β-巰基乙醇等還原劑保持蛋白穩(wěn)定性。
復(fù)溶操作：根據(jù)蛋白濃度，加入適量緩沖液使終濃度達(dá)到0.1-1.0mg/mL（部分難溶蛋白可適當(dāng)調(diào)整濃度）；輕輕顛倒離心管或用移液器緩慢吹打混勻，避免劇烈震蕩；置于冰上靜置10-30分鐘，期間可輕柔混勻2-3次，確保蛋白充分溶解。
2. 活性測(cè)定（以酶類(lèi)蛋白為例）
試劑準(zhǔn)備：根據(jù)酶的催化特性，配制相應(yīng)的底物溶液、輔助因子溶液、反應(yīng)緩沖液等；確保所有試劑均為分析純以上級(jí)別，且在有效期內(nèi)。
反應(yīng)體系優(yōu)化：通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定酶的最適反應(yīng)溫度、pH值、底物濃度、酶濃度等參數(shù)；通常反應(yīng)體系體積為50-200μL，酶濃度需根據(jù)活性高低調(diào)整。
檢測(cè)操作：按照優(yōu)化后的反應(yīng)體系依次加入試劑，啟動(dòng)反應(yīng)后，通過(guò)分光光度法、熒光法、比色法等檢測(cè)方法，實(shí)時(shí)或終點(diǎn)檢測(cè)底物消耗、產(chǎn)物生成的信號(hào)變化。
活性計(jì)算：根據(jù)檢測(cè)到的信號(hào)變化值，結(jié)合摩爾消光系數(shù)、熒光量子產(chǎn)率等參數(shù)，計(jì)算酶的活性單位（U）；1U定義為在特定條件下，每分鐘催化1μmol底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的酶量。
3. Western Blot檢測(cè)
樣品處理：取適量復(fù)溶后的蛋白溶液，加入等體積的2×SDS上樣緩沖液，沸水浴加熱5-10分鐘使蛋白變性；若蛋白含二硫鍵，可添加β-巰基乙醇或DTT輔助變性。
電泳分離：將變性后的樣品加入SDS-PAGE凝膠的上樣孔，同時(shí)加入蛋白Marker；先以80V電壓運(yùn)行濃縮膠（約30分鐘），待樣品進(jìn)入分離膠后，調(diào)整電壓至120V繼續(xù)電泳（約60-90分鐘），直至蛋白Marker分離清晰。
轉(zhuǎn)膜操作：根據(jù)蛋白分子量選擇合適孔徑的PVDF或NC膜；采用濕轉(zhuǎn)或半干轉(zhuǎn)法將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移至膜上，濕轉(zhuǎn)條件通常為200-300mA電流，轉(zhuǎn)膜時(shí)間60-120分鐘；轉(zhuǎn)膜后可通過(guò)麗春紅染色確認(rèn)轉(zhuǎn)膜效果。
封閉與孵育：用5%脫脂牛奶或BSA溶液封閉膜1-2小時(shí)，封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)；加入一抗（按說(shuō)明書(shū)推薦比例稀釋?zhuān)?℃孵育過(guò)夜；次日用TBST緩沖液洗膜3次，每次10分鐘；加入HRP標(biāo)記的二抗（按說(shuō)明書(shū)推薦比例稀釋?zhuān)?，室溫孵?小時(shí)；再次用TBST緩沖液洗膜3次，每次10分鐘。
顯色檢測(cè)：將膜浸入ECL化學(xué)發(fā)光試劑中，避光孵育1-5分鐘；使用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)曝光檢測(cè)蛋白條帶，根據(jù)條帶位置和灰度分析蛋白表達(dá)情況。
關(guān)鍵字： 大鼠酪氨酸3/色氨酸5單加氧酶活化蛋白θ;YWHAq;重組蛋白;
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