本產(chǎn)品僅供科研
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產(chǎn)品名稱：肉毒梭狀芽孢桿菌E型外毒素基因探針法熒光定量PCR試劑盒
1. 即開即用，用戶只需要提供樣品 DNA 模板。
2. 引物和探針經(jīng)過優(yōu)化，靈敏性高。
3. 提供陽性對照，便于區(qū)分假陰性樣品。
4. 特異性高，不會跟其他微生物的 DNA 發(fā)生交叉反應(yīng)。
5. 既可用于定性檢測，又可用于定量檢測。用于定量檢測時線性范圍至少為 5個數(shù)量級。
6. 本產(chǎn)品足夠 50 次 20μL 體系的探針法熒光定量 PCR 反應(yīng)。
7. 本產(chǎn)品只能用于科研。
包裝規(guī)格及成分（具體信息詳見說明書）：
編號 | 成分 | 規(guī)格 |
試劑一 | 探針法qRT-PCR緩沖液 | 500μL |
試劑二 | 探針法qRT-PCR酶混合液 | 50μL |
試劑三 | 熒光PCR專用模板稀釋液 | 1mL |
試劑四 | PCR引物-探針干粉 | 50T |
試劑五 | PCR陽性對照(107拷貝/μL) | 50μL |
肉毒梭狀芽孢桿菌E型外毒素基因探針法熒光定量PCR試劑盒操作過程：
一、稀釋標準曲線樣品（以 10E1-10E6 拷貝/μL 這6 個10 倍稀釋度為例）。由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的DNA 片段作為陽性對照。
1. 標記 6 個離心管，分別為 6，5，4，3，2，1。
2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭，下同。
3. 在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
4. 換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
5. 換槍頭，在 4 號管中加入 5 μL 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E4 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
6. 重復(fù)上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。
二、樣品 DNA 的制備
1. 如果有 N 個樣品待提取，最好設(shè)置 N+2 個提取，多出的是PC（樣品制備陽性對照）和 NC（樣品制備陰性對照）?？梢匀￡栃詫φ盏?000倍稀釋液10μL 再加上一定量的水，使總體積與待提取樣品的規(guī)定體積一致，以此作為 PC。另外用水作為 NC。
2. 用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù)DNA提取試劑盒兼容。
三、設(shè)置qPCR反應(yīng)（20μL體系，在樣品制備室進行）
如果進行定量分析，則標記N+9個PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于PCR陰性對照，6個用于標準曲線樣品。如果做定性分析，則6個標準曲線樣品只選一個做（可以選4號，其余樣品不變）。以下只介紹定量分析的反應(yīng)設(shè)置。
四、數(shù)據(jù)處理
1. 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的log 值為橫軸，以Ct值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標準曲線上推算出樣品核酸濃度的 log 值，再推算出其濃度。
2. 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照Ct 必須大于或等于 40。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長，有典型擴增曲
線，Ct 值應(yīng)該小于或等于 39。對待測樣品，如果其 Ct 大于或等于40 則為陰性，如果小于或等于 39 則為陽性。如果在 39-40 之間，
則重復(fù)一次。重復(fù)實驗的Ct值如果大于或等于 40 則為陰性，如果小于 40，則為陽性。
| 成分 | 樣品管N+2個 | RT-PCR陰性對照管 | 標準曲線樣品管
（2-7 管） |
| 探針法qPCR緩沖液 | 各 10 μL | 10 μL | 各 10 μL |
| 探針法 qPCR 酶混合液 | 各 2 μL | 2 μL | 各 2 μL |
| qRT-PCR探針 | 各 1 μL | 1 μL | 各 1 μL |
探針qRT-PCR
引物混合液 | 各 2 μL | 2 μL | 各 2 μL |
| 待測樣品 RNA 模板 | 各 5 μL | -- | -- |
| 超純水 | -- | 5 μL | -- |
| 第 7 步所得標準曲線樣品稀釋液（2-7 號） | -- | -- | 各5 μL（2號樣到2號管，3號樣到3 號管…） |
蓋上蓋子后上機，按下面參數(shù)進行 qRT-PCR：
| 過程 | 溫度 | 時間 |
| 逆轉(zhuǎn)錄 | 50℃ | 30 min |
| 預(yù)變性 | 94℃ | 10 min |
| qRT-PCR 反應(yīng)（40 個循環(huán)） | 94℃ | 15 sec |
| 60℃ | 1 min（采集 FAM 通道的熒光信號）
|
保存條件：-20℃
保質(zhì)期：12個月
肉毒梭狀芽孢桿菌E型外毒素基因探針法熒光定量PCR試劑盒檢測方法的局限性
A.樣本檢測結(jié)果與樣本收集、處理、運送以及保存質(zhì)量有關(guān)；
B.樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會出現(xiàn)假陽性結(jié)果；
C.陽性對照、擴增產(chǎn)物泄漏，會導(dǎo)致假陽性結(jié)果；
D.病原體在流行過程中基因突變、重組，會導(dǎo)致假陰性結(jié)果；
E.不同的提取方法存在提取效率差異，會導(dǎo)致假陰性結(jié)果；
F.試劑運輸，保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降，出現(xiàn)假陰性或定量檢測不準確的結(jié)果；
肉毒梭狀芽孢桿菌E型外毒素基因探針法熒光定量PCR試劑盒注意事項
1操作嚴格按照說明書進行；
2試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)自然融化，完全混勻并短暫離心；
3反應(yīng)液應(yīng)避光保存；
4反應(yīng)中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；
5使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專用工作服；
6樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進行，以免交叉污染；
7實驗完畢后用10%次氯酸或75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器
關(guān)鍵字： 肉毒梭狀芽孢桿菌E型外毒素基因探針法熒光;Clostridiumbotulinum;PCR熒光蛋白試劑盒;實時熒光PCR檢測法;雅吉PCR試劑盒;
上海雅吉生物科技的核心業(yè)務(wù)主要圍繞生命科學研究所需的各類試劑、細胞、抗體及技術(shù)服務(wù)展開，具體可歸納為以下幾個方面：
細胞產(chǎn)品與技術(shù)平臺：
細胞產(chǎn)品：提供包括正常細胞、腫瘤細胞、腫瘤耐藥細胞在內(nèi)的多種細胞系。同時，公司也是美國ScienCell等品牌的原代細胞產(chǎn)品的代理商。
穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株構(gòu)建服務(wù)：公司具備豐富的蛋白表達研究經(jīng)驗，能夠為客戶提供從基因序列到穩(wěn)定細胞株交付的一站式定制服務(wù)，應(yīng)用于基因功能研究、藥物篩選和重組蛋白生產(chǎn)等領(lǐng)域。
科研試劑：這是公司的基礎(chǔ)和優(yōu)勢業(yè)務(wù)。產(chǎn)品線全面覆蓋了分子生物學、免疫學、細胞生物學和微生物學等多個學科。
ELISA試劑盒：提供人、大鼠、小鼠、犬、魚、雞、牛等多種物種以及植物的ELISA檢測試劑盒，在國內(nèi)眾多重點實驗室中廣泛使用并被科研文獻引用。生化試劑、抗體與血清：提供包括一抗、二抗、單克隆/多克隆抗體在內(nèi)的多種抗體產(chǎn)品，以及胎牛血清等細胞培養(yǎng)用血清。
蛋白研究相關(guān)試劑盒：提供超過300種針對不同樣本來源（動物、植物、微生物）和不同細胞器（如線粒體、外泌體）的蛋白提取及檢測試劑盒。