體外泛素化實(shí)驗(yàn)服務(wù) – E3連接酶-底物關(guān)系驗(yàn)證 / 泛素化位點(diǎn)鑒定 / 去泛素化酶(DUB)活性檢測(cè)

體外泛素化實(shí)驗(yàn)（In Vitro Ubiquitination Assay） 是研究泛素-蛋白酶體系統(tǒng)及蛋白泛素化修飾的核心體外檢測(cè)技術(shù)，廣泛應(yīng)用于E3泛素連接酶與底物關(guān)系驗(yàn)證、泛素化位點(diǎn)鑒定、去泛素化酶（DUB）活性評(píng)價(jià)及泛素化機(jī)制解析等研究領(lǐng)域。本公司提供從泛素相關(guān)蛋白表達(dá)純化、體外泛素化/去泛素化反應(yīng)體系構(gòu)建、泛素化檢測(cè)（Western Blot/質(zhì)譜）到泛素化位點(diǎn)質(zhì)譜鑒定的全流程一站式體外泛素化實(shí)驗(yàn)服務(wù)，助力客戶精準(zhǔn)解析蛋白泛素化修飾的調(diào)控機(jī)制與生物學(xué)功能。

服務(wù)技術(shù)原理

蛋白泛素化是一種動(dòng)態(tài)、可逆的翻譯后修飾，通過泛素活化酶（E1）、泛素結(jié)合酶（E2） 和泛素連接酶（E3） 的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，將泛素（Ubiquitin） 共價(jià)連接到底物蛋白的賴氨酸殘基上。去泛素化則由去泛素化酶（DUB） 催化，去除底物上的泛素修飾。

體外泛素化實(shí)驗(yàn)是在體外模擬這一生化過程：將純化的E1、E2、E3酶與底物蛋白及泛素在含有ATP的適宜緩沖體系中共同孵育，通過檢測(cè)底物蛋白上泛素鏈的形成情況來評(píng)估E3連接酶對(duì)底物的泛素化活性。該反應(yīng)體系完全排除細(xì)胞內(nèi)的復(fù)雜背景，能夠直接驗(yàn)證E3與底物之間的泛素化關(guān)系。反應(yīng)結(jié)束后，產(chǎn)物通過SDS-PAGE分離，利用泛素抗體或底物蛋白特異性抗體進(jìn)行Western Blot檢測(cè)，可清晰觀察到底物泛素化產(chǎn)生的典型“條帶拖尾”或高分子量條帶。如需精確定位泛素化修飾位點(diǎn)，則可結(jié)合質(zhì)譜（LC-MS/MS） 進(jìn)行分析。

去泛素化實(shí)驗(yàn)則在體外泛素化反應(yīng)制備的泛素化底物的基礎(chǔ)上，加入純化的DUB或免疫沉淀獲得的內(nèi)源DUB復(fù)合物，通過監(jiān)測(cè)底物泛素化信號(hào)的減弱來評(píng)價(jià)去泛素化酶活性。

主要服務(wù)內(nèi)容

泛素化相關(guān)蛋白表達(dá)純化：根據(jù)客戶需求提供E1、E2（UbcH5b、UbcH7等）、E3連接酶（含RING、HECT、RBR家族）、野生型泛素及泛素突變體（如K48-only、K63-only、K0）的重組蛋白表達(dá)與純化服務(wù)；支持客戶提供純化蛋白或基因信息；

體外泛素化反應(yīng)體系建立與優(yōu)化：根據(jù)E3連接酶-底物組合特性，優(yōu)化反應(yīng)緩沖液（pH、離子強(qiáng)度、ATP濃度、Mg2?/DTT等）、酶配比（E1:E2:E3梯度優(yōu)化）及反應(yīng)時(shí)間等關(guān)鍵參數(shù)；

體外泛素化反應(yīng)（單輪或多輪）：

單輪泛素化：使用泛素突變體（如K0）僅進(jìn)行單泛素修飾，避免泛素鏈延伸，便于檢測(cè)單泛素化狀態(tài)；

多輪泛素化：使用野生型泛素進(jìn)行多聚泛素鏈形成，模擬體內(nèi)多泛素化修飾（K48/K63等連接類型）；

泛素化檢測(cè)與分析：

Western Blot檢測(cè)：使用泛素抗體（FK2、P4D1等）或底物蛋白特異性抗體檢測(cè)底物泛素化信號(hào)，呈現(xiàn)特征性“條帶拖尾”或高分子量條帶；

質(zhì)譜（LC-MS/MS）泛素化位點(diǎn)鑒定：將泛素化產(chǎn)物酶解后富集，經(jīng)LC-MS/MS鑒定底物上具體的泛素化修飾位點(diǎn)及泛素鏈連接類型；

去泛素化實(shí)驗(yàn)（DUB活性檢測(cè)） ：將純化或免疫沉淀獲得的DUB與泛素化底物共孵育，通過Western Blot檢測(cè)泛素化信號(hào)的減弱，評(píng)價(jià)DUB的切割活性與特異性；

對(duì)照實(shí)驗(yàn)體系：設(shè)置無ATP對(duì)照組（驗(yàn)證ATP依賴性）、無E3對(duì)照組（排除E2自泛素化背景）、熱失活E3對(duì)照組（驗(yàn)證E3活性依賴性），確保結(jié)果特異性。

典型應(yīng)用場(chǎng)景

E3泛素連接酶-底物關(guān)系驗(yàn)證：直接驗(yàn)證候選E3連接酶是否能夠介導(dǎo)目標(biāo)底物的泛素化，是泛素化機(jī)制研究的核心驗(yàn)證手段；

泛素化類型與連接方式鑒定：利用泛素突變體（K48-only、K63-only）或連接特異性抗體，明確泛素鏈的連接類型（K48-泛素化/降解信號(hào) vs K63-泛素化/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)）；

泛素化關(guān)鍵賴氨酸位點(diǎn)鑒定：結(jié)合底物賴氨酸點(diǎn)突變與質(zhì)譜鑒定，精確定位介導(dǎo)泛素化修飾的關(guān)鍵位點(diǎn)；

去泛素化酶（DUB）活性檢測(cè)與底物篩選：評(píng)價(jià)特定DUB對(duì)泛素化底物的切割效率與特異性；

泛素-蛋白酶體通路機(jī)制研究：解析蛋白降解、細(xì)胞周期、DNA損傷修復(fù)、免疫應(yīng)答等生理過程中的泛素化調(diào)控機(jī)制；

疾病相關(guān)泛素化異常研究：比較正常與腫瘤、神經(jīng)退行性疾病等病理狀態(tài)下的泛素化水平差異；

E3/DUB抑制劑篩選：評(píng)估小分子化合物對(duì)E3連接酶或DUB活性的抑制效果，用于藥物早期篩選。

服務(wù)優(yōu)勢(shì)（為什么選擇我們）

反應(yīng)體系完全可控：可精準(zhǔn)調(diào)控E1/E2/E3酶配比、ATP濃度、反應(yīng)時(shí)間等參數(shù)，排除細(xì)胞復(fù)雜背景干擾，結(jié)果特異性強(qiáng)、重復(fù)性高；

直接驗(yàn)證，規(guī)避間接調(diào)控：體外反應(yīng)可直接驗(yàn)證E3連接酶對(duì)底物的直接泛素化作用，不受內(nèi)源其他調(diào)控因子影響；

靈活的泛素變體支持：可使用K48-only、K63-only、K0、His-泛素、HA-泛素等多種泛素突變體及標(biāo)簽變體，滿足不同研究需求；

雙檢測(cè)平臺(tái)可選：同時(shí)支持Western Blot（檢測(cè)泛素化信號(hào)強(qiáng)度/拖尾形態(tài)）和質(zhì)譜（精確定位泛素化位點(diǎn)），兼顧效率與深度；

一站式全流程服務(wù)：從基因合成、蛋白表達(dá)純化到體外泛素化反應(yīng)、檢測(cè)鑒定的閉環(huán)技術(shù)服務(wù)；

去泛素化實(shí)驗(yàn)配套支持：不僅提供正向泛素化實(shí)驗(yàn)，還可配套DUB活性檢測(cè)服務(wù)，全面覆蓋泛素化-去泛素化動(dòng)態(tài)調(diào)控研究；

周期短、效率高：體外生化反應(yīng)快速高效，無需構(gòu)建細(xì)胞模型或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，大幅縮短驗(yàn)證周期。

樣本要求與交付周期

樣本類型    要求    備注

E3/底物基因信息    提供基因ID、CDS序列或氨基酸序列    用于載體構(gòu)建及蛋白表達(dá)

純化蛋白（客戶提供）    E3≥10μg；底物≥20μg（濃度≥0.5μg/μL）    需提供純度及活性信息

E1/E2蛋白（客戶提供）    各≥5μg    若缺失，我方提供配套商業(yè)來源的E1/E2

泛素及泛素突變體（客戶提供）    野生型泛素≥20μg    若缺失，我方提供配套商業(yè)來源的泛素

目的蛋白抗體    用于泛素化WB檢測(cè)的抗體    推薦泛素抗體FK2/P4D1及底物特異性抗體

交付周期：

重組蛋白表達(dá)+泛素化檢測(cè)：4~6周

客戶提供蛋白+泛素化檢測(cè)：1~2周

泛素化位點(diǎn)質(zhì)譜鑒定：額外增加2~3周

去泛素化實(shí)驗(yàn)（含DUB表達(dá)/純化）：4~6周（若客戶提供DUB，1~2周）

交付內(nèi)容：

完整的實(shí)驗(yàn)報(bào)告（含蛋白純化記錄、反應(yīng)體系參數(shù)、檢測(cè)方法等）；

原始數(shù)據(jù)及結(jié)果圖片（Western Blot膠片/成像圖，質(zhì)譜譜圖等）；

泛素化信號(hào)定量分析（灰度比值或反應(yīng)動(dòng)力學(xué)曲線）；

若委托質(zhì)譜鑒定，交付泛素化位點(diǎn)鑒定報(bào)告（含修飾位點(diǎn)、泛素鏈類型分析）；

實(shí)驗(yàn)結(jié)論及結(jié)果解讀。

常見問題（FAQ）

Q：體外泛素化實(shí)驗(yàn)與細(xì)胞內(nèi)的泛素化檢測(cè)有什么不同？

A：細(xì)胞內(nèi)的泛素化檢測(cè)（如泛素化WB檢測(cè)細(xì)胞裂解液）反映的是細(xì)胞內(nèi)在生理狀態(tài)下底物是否已被泛素化修飾，但無法明確是哪個(gè)E3連接酶介導(dǎo)的。體外泛素化實(shí)驗(yàn)則是在受控的體外體系中，直接驗(yàn)證特定E3連接酶是否能夠直接催化底物的泛素化，是因果關(guān)系驗(yàn)證的“金標(biāo)準(zhǔn)”手段。兩者互為補(bǔ)充：體內(nèi)實(shí)驗(yàn)回答“有沒有被泛素化”，體外實(shí)驗(yàn)回答“是由哪個(gè)E3泛素化修飾的”。

Q：體外泛素化實(shí)驗(yàn)?zāi)軈^(qū)分K48-泛素化和K63-泛素化嗎？

A：能。我們提供兩種策略進(jìn)行區(qū)分：① 使用泛素突變體（如K48-only僅能形成K48連接，K63-only僅能形成K63連接），通過對(duì)比不同突變體下的泛素化條帶形態(tài)差異來判斷連接類型；② 使用連接特異性抗體（如抗K48-泛素鏈或抗K63-泛素鏈抗體）進(jìn)行Western Blot檢測(cè)，可直接鑒定泛素鏈的連接類型。K48-泛素化通常形成高分子量彌散帶，K63-泛素化形成的條帶更為離散、分子量更高且常呈階梯狀。

Q：體外泛素化反應(yīng)的“拖尾條帶”不清晰或完全檢測(cè)不到怎么辦？

A：出現(xiàn)這種情況時(shí)，我們提供系統(tǒng)的優(yōu)化方案：① 調(diào)整E1:E2:E3的摩爾比（通常E3為限速酶，適當(dāng)提高其占比），不同E3對(duì)E2的偏好性不同，我們的技術(shù)團(tuán)隊(duì)會(huì)根據(jù)您的E3類型推薦最優(yōu)配比（如RING型與HECT型E3的配比方案差異顯著）；② 優(yōu)化ATP濃度、Mg2?濃度、DTT及反應(yīng)溫度；③ 延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間；④ 改用靈敏度更高的檢測(cè)抗體（如FK2單抗）。泛素化信號(hào)微弱可能也意味著E3活性不足——我們的預(yù)實(shí)驗(yàn)會(huì)評(píng)估E3蛋白的折疊狀態(tài)與活性，確保投入反應(yīng)的E3具有正確構(gòu)象。

Q：體外泛素化實(shí)驗(yàn)中觀察到E2的自泛素化背景怎么辦？

A：某些E2酶本身具有自泛素化能力，可能在體外反應(yīng)中產(chǎn)生背景信號(hào)，干擾底物泛素化的判讀。我們通過設(shè)置無E3對(duì)照組來識(shí)別E2自泛素化背景，并結(jié)合底物特異性抗體（而非泛素抗體）進(jìn)行檢測(cè)，優(yōu)先捕捉底物蛋白本身分子量的上移，以此區(qū)分底物泛素化與E2自泛素化。

Q：體外泛素化實(shí)驗(yàn)?zāi)苤苯幼C明底物被降解嗎？

A：不能直接證明。泛素化是降解的信號(hào)，但并非所有泛素化都導(dǎo)致降解（如K63-泛素化主要參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)而非降解）。若需驗(yàn)證泛素化是否導(dǎo)致底物降解，建議進(jìn)一步開展體外降解實(shí)驗(yàn)（將泛素化反應(yīng)產(chǎn)物與純化26S蛋白酶體共孵育，檢測(cè)底物剩余量）或細(xì)胞/動(dòng)物水平的蛋白穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)（CHX追蹤實(shí)驗(yàn)）。我們可配套提供體外降解檢測(cè)服務(wù)，具體請(qǐng)咨詢。

Q：去泛素化實(shí)驗(yàn)需要哪些組分？為什么檢測(cè)不到切割活性？

A：去泛素化實(shí)驗(yàn)的核心組分為：① 泛素化底物（通過體外泛素化反應(yīng)制備，其制備質(zhì)量直接影響后續(xù)DUB切割效果）；② DUB酶（純化重組DUB或免疫沉淀內(nèi)源DUB復(fù)合物）；③ 反應(yīng)緩沖液（含DTT等還原劑維持DUB活性中心的半胱氨酸處于還原狀態(tài)）。如果檢測(cè)不到切割活性，可能原因包括：DUB活性中心被氧化（可通過補(bǔ)充DTT解決）、泛素化底物的連接類型與DUB偏好性不匹配（DUB對(duì)K48/K63鏈有不同偏好）、反應(yīng)時(shí)間或溫度不適宜。我們會(huì)通過設(shè)置陽性對(duì)照底物來確認(rèn)DUB活性。

Q：能否做泛素化相關(guān)的藥物篩選（E3/DUB抑制劑）？

A：可以。我們提供完整的E3連接酶和DUB抑制劑篩選服務(wù)。在體外泛素化或去泛素化反應(yīng)體系中加入梯度濃度的小分子化合物（或天然產(chǎn)物提取物），通過檢測(cè)泛素化信號(hào)的增強(qiáng)（E3抑制劑）或減弱（DUB抑制劑）來判斷藥效，并計(jì)算IC??值。支持單濃度初篩與全濃度IC??精確測(cè)定兩種模式。

歡迎聯(lián)系我們的技術(shù)團(tuán)隊(duì)，獲取免費(fèi)體外泛素化實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)與報(bào)價(jià)。我們致力于以專業(yè)、規(guī)范、可重復(fù)的體外泛素化檢測(cè)服務(wù)，為您的泛素化修飾機(jī)制研究與藥物靶點(diǎn)驗(yàn)證提供最可靠的數(shù)據(jù)支撐。