Recombinant Human RAP1A

Recombinant Human RAP1A（人重組RAP1A蛋白）是一種在大腸桿菌中表達的高純度重組蛋白，作為小GTP酶Ras家族成員，它在細胞黏附、增殖及Ras信號通路調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵作用，常被用作信號轉(zhuǎn)導研究的工具蛋白。

商品介紹：

別稱：C21KG, G 22K, G-22K, GTP binding protein smg p21A, GTP-binding protein smg p21A, KREV 1, KREV1, OTTHUMP00000013741, RAP 1A, RAP1, RAP1A, RAP1A member of RAS oncogene family, RAP1A_HUMAN, Ras related protein Krev 1, Ras related protein Rap 1A, RAS related protein RAP1A, Ras-related protein Krev-1, Ras-related protein Rap-1A, SMGP21

標簽：N-terminal His Tag

種屬：Human

宿主：E.Coli

表達區(qū)間：1-181

分子量：19.8 kDa

                 Greater than 95% as determined by SDS-PAGE

應(yīng)用：Western Blot, ELISA

性狀：Lyophilized from a 0.2 μm filtered solution in 10 mM Hepes, 500 mM NaCl with 5% trehalose, pH7.4

純度：Greater than 95% as determined by SDS-PAGE

溶解方法:Centrifuge the vial at 10,000 rpm for 1 minute, reconstitute at 200 μg/ml in sterile distilled water by gentle pipetting 2-3 times, don’t vortex

存儲:-20°C for 12 months as lyophilized; 2-8°C for 1 month under sterile conditions after reconstitution

檢測原理詳解：

包被抗體結(jié)合

實驗開始前，微孔板已預先包被抗人白脂素單克隆抗體。當加入待測樣本后，

樣本中的人白脂素（Asprosin）會與固相載體上的捕獲抗體特異性結(jié)合。

形成“夾心復合物”

洗滌去除未結(jié)合物質(zhì)后，加入生物素標記的檢測抗體，該抗體與白脂素分子的另一表位結(jié)合，

形成“固相抗體—抗原—檢測抗體”三明治結(jié)構(gòu)。

酶促顯色反應(yīng)

隨后加入?辣根過氧化物酶（HRP）標記的鏈霉親和素，與生物素檢測抗體結(jié)合。

最后加入TMB顯色底物，在HRP催化下產(chǎn)生藍色產(chǎn)物，反應(yīng)終止后變?yōu)辄S色。

濃度定量分析

黃色深淺與樣本中白脂素含量成正比，通過酶標儀在450nm波長處測定吸光度（OD值），

并根據(jù)標準曲線計算出樣本中白脂素的濃度。

公司正在出售的產(chǎn)品：

1. 基因克隆與表達載體構(gòu)建

從人類FBN1基因C端序列中擴增Asprosin編碼片段（約140aa）。

將目的片段插入原核表達載體，確保帶有?N端或C端His標簽，便于后續(xù)純化。

轉(zhuǎn)化至?感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆并測序驗證。

2. 重組蛋白誘導表達

取陽性菌落接種于LB培養(yǎng)基（含氨芐青霉素），37℃振蕩培養(yǎng)過夜。

次日按1:100比例轉(zhuǎn)接至新鮮LB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)至OD600達0.6–0.8。

加入IPTG至終濃度0.1–1.0 mM，16–25℃誘導表達6–12小時（低溫誘導有助于可溶性達）。

4℃、8000×g離心10分鐘收集菌體，棄上清，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3. 菌體裂解與蛋白提取

將菌體沉淀重懸于裂解緩沖液（如PBS + 1% Triton X-100 + 蛋白酶抑制劑），超聲破碎

（冰浴條件下，每次30秒，共6–10次，功率30%）。

4℃、12000×g離心20分鐘，收集上清（可溶性蛋白）或沉淀（包涵體蛋白）。

若為包涵體蛋白，需用?洗滌緩沖液（含2M尿素的PBS）洗滌2–3次，去除雜蛋白。

4. 親和層析純化（Ni-NTA法）

將含His標簽的蛋白溶液（或溶解后的包涵體蛋白，使用含6–8M尿素的緩沖液溶解）上樣至?Ni-NTA親和層析柱。

用?洗滌緩沖液（含20–40mM咪唑）洗去非特異性結(jié)合蛋白。

用?洗脫緩沖液（含250–500mM咪唑）梯度洗脫目標蛋白，收集洗脫峰。

透析去除尿素與咪唑（使用PBS或生理緩沖液，4℃過夜，更換3次）。

5. 蛋白復性（針對包涵體蛋白）

若蛋白以包涵體形式表達，需在純化后進行?梯度復性：

將變性蛋白緩慢加入含?梯度降低尿素（6M → 4M → 2M → 0M）的復性緩沖液中，4℃攪拌過夜。或采用?透析法?逐步去除變性劑。復性后再次離心取上清，檢測蛋白活性。