基本信息?
產(chǎn)品名稱 | Gibson無(wú)縫克隆試劑盒 | 貨號(hào) | P-PR1323 |
規(guī)格 | 10T、50T | 用途 | 僅供科研 |
?英文名稱?：Gibson Seamless Cloning Kit
作用機(jī)制：利用DNA聚合酶、T5核酸外切酶與DNA連接酶，實(shí)現(xiàn)多個(gè)DNA片段的無(wú)縫克隆；T5核酸外切酶切割DNA片段末端，產(chǎn)生單鏈突出端，DNA片段通過(guò)同源序列互補(bǔ)配對(duì)，隨后DNA聚合酶修復(fù)缺口，DNA連接酶連接形成完整的重組DNA分子。
適用樣本：多個(gè)DNA片段的無(wú)縫拼接、載體構(gòu)建、基因修飾等實(shí)驗(yàn)，無(wú)需限制性內(nèi)切酶與連接酶的傳統(tǒng)克隆步驟。
產(chǎn)品概述
Gibson無(wú)縫克隆試劑盒是基于Gibson Assembly技術(shù)的分子克隆試劑盒，由Daniel G. Gibson開發(fā)，是實(shí)現(xiàn)多片段DNA無(wú)縫拼接的高效工具。該試劑盒包含三種關(guān)鍵酶：5'核酸外切酶、DNA聚合酶與DNA連接酶。5'核酸外切酶可消化DNA片段末端的5'單鏈區(qū)域，產(chǎn)生3'突出末端；DNA聚合酶可填充相鄰DNA片段末端的缺口；DNA連接酶則催化連接缺口處的磷酸二酯鍵，最終實(shí)現(xiàn)多個(gè)DNA片段的無(wú)縫拼接。Gibson無(wú)縫克隆技術(shù)無(wú)需限制性內(nèi)切酶切割與T4 DNA連接酶連接，僅需將帶有同源末端（通常為20-40個(gè)堿基對(duì)）的多個(gè)DNA片段與Gibson酶混合物混合，在50℃條件下孵育即可完成重組。該試劑盒可同時(shí)拼接2-10個(gè)甚至更多的DNA片段，拼接效率高，適用于復(fù)雜載體構(gòu)建、基因組合成、代謝途徑工程等多種分子生物學(xué)研究場(chǎng)景，為合成生物學(xué)與基因工程研究提供了強(qiáng)大的技術(shù)支持。
產(chǎn)品特點(diǎn)
多片段同時(shí)拼接：一次反應(yīng)可拼接2-10個(gè)DNA片段，實(shí)現(xiàn)復(fù)雜基因組合成與載體構(gòu)建。
無(wú)縫連接技術(shù)：通過(guò)5'核酸外切酶、DNA聚合酶、DNA連接酶協(xié)同作用，實(shí)現(xiàn)片段間無(wú)縫拼接，無(wú)冗余序列。
高效重組效率：多片段拼接效率≥80%，比傳統(tǒng)酶切連接方法效率高10-20倍。
廣泛應(yīng)用場(chǎng)景：適用于代謝途徑工程、合成生物學(xué)、基因敲除載體構(gòu)建等復(fù)雜分子克隆操作。
實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備
試劑與耗材檢查：確認(rèn)PCR預(yù)混液、上下游引物、模板DNA、無(wú)酶水等試劑在有效期內(nèi)，外觀無(wú)渾濁、沉淀；PCR管、槍頭需為無(wú)酶無(wú)菌規(guī)格。
儀器預(yù)熱：提前10-15分鐘啟動(dòng)PCR儀，設(shè)置好反應(yīng)程序，確保儀器達(dá)到預(yù)設(shè)溫度。
環(huán)境準(zhǔn)備：在超凈工作臺(tái)內(nèi)操作，佩戴無(wú)粉手套，避免交叉污染；操作前用75%酒精擦拭臺(tái)面和移液器。
反應(yīng)體系配制
冰上操作：將所有試劑放置于冰盒內(nèi)，避免酶失活。
體系配比（以25μL體系為例）：
PCR預(yù)混液（含Taq酶、dNTP、Buffer）：12.5μL
上游引物（10μM）：1μL
下游引物（10μM）：1μL
模板DNA：1-5μL（根據(jù)模板濃度調(diào)整）
無(wú)酶水：補(bǔ)足至25μL
輕柔混勻：用移液器輕輕吹吸混合液3-5次，避免產(chǎn)生氣泡；若有氣泡可短暫離心去除。
分裝體系：將配制好的反應(yīng)液分裝至PCR管中，每管25μL，蓋緊管蓋。
PCR儀上機(jī)反應(yīng)
程序設(shè)置：根據(jù)引物Tm值和實(shí)驗(yàn)需求設(shè)置三步法或兩步法程序：
預(yù)變性：95℃，3-5分鐘
循環(huán)階段：95℃變性30秒，55-65℃退火30秒，72℃延伸（根據(jù)片段長(zhǎng)度調(diào)整，1kb約1分鐘），循環(huán)25-35次
終延伸：72℃，5-10分鐘
保溫：4℃。
上機(jī)運(yùn)行：將PCR管放入PCR儀樣品槽，確保管蓋緊密貼合；啟動(dòng)程序，等待反應(yīng)完成。
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注意事項(xiàng)
無(wú)菌操作：所有試劑和耗材需高壓滅菌或無(wú)菌處理，避免外源DNA污染
溫度控制：酶、dNTP等試劑需-20℃儲(chǔ)存，避免反復(fù)凍融
體系優(yōu)化：根據(jù)引物Tm值、模板類型調(diào)整Mg2+濃度和退火溫度
對(duì)照設(shè)置：每次實(shí)驗(yàn)需設(shè)置陰性對(duì)照（無(wú)模板）和陽(yáng)性對(duì)照（已知陽(yáng)性模板）
關(guān)鍵字： Gibson無(wú)縫克隆試劑盒;Gibson Seamless Clon;
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