Recombinant Human HIF-1A

Recombinant Human HIF-1α（重組人缺氧誘導(dǎo)因子-1α）是一種在科研中廣泛應(yīng)用的重組蛋白，通常通過(guò)基因工程技術(shù)在大腸桿菌（E. coli）等表達(dá)系統(tǒng)中生產(chǎn)。HIF-1α是細(xì)胞感知和適應(yīng)低氧環(huán)境的核心轉(zhuǎn)錄因子，作為HIF-1異源二聚體的氧調(diào)節(jié)亞基，它在氧氣充足時(shí)極不穩(wěn)定，會(huì)被迅速降解；而在缺氧條件下則會(huì)穩(wěn)定并進(jìn)入細(xì)胞核，與HIF-1β結(jié)合，激活一系列涉及血管生成、糖代謝和紅細(xì)胞生成的基因表達(dá)。由于其在腫瘤代謝、免疫調(diào)節(jié)及缺血性疾病中的關(guān)鍵作用，重組人HIF-1α蛋白主要用于相關(guān)信號(hào)通路機(jī)?螜?

商品介紹：

別稱(chēng)：ARNT interacting protein, bHLHe78, HIF 1 alpha, HIF 1alpha, HIF1, HIF1 ALPHA, HIF1A, HIF-1α, Member of PAS protein 1, MOP1, PASD8

標(biāo)簽：N-terminal His Tag

種屬：Human

宿主：E.Coli

表達(dá)區(qū)間：574-799

分子量：26.5 KDa

應(yīng)用：Western Blot, ELISA

性狀：Lyophilized from a 0.2 μm filtered solution in PBS with 5% trehalose, pH7.4

純度：Greater than 95% as determined by SDS-PAGE

溶解方法:Centrifuge the vial at 10,000 rpm for 1 minute, reconstitute at 200 μg/ml in sterile distilled water by gentle pipetting 2-3 times, don’t vortex

存儲(chǔ):-20°C for 12 months as lyophilized; 2-8°C for 1 month under sterile conditions after reconstitution

檢測(cè)原理詳解：

包被抗體結(jié)合

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，微孔板已預(yù)先包被抗人白脂素單克隆抗體。當(dāng)加入待測(cè)樣本后，

樣本中的人白脂素（Asprosin）會(huì)與固相載體上的捕獲抗體特異性結(jié)合。

形成“夾心復(fù)合物”

洗滌去除未結(jié)合物質(zhì)后，加入生物素標(biāo)記的檢測(cè)抗體，該抗體與白脂素分子的另一表位結(jié)合，

形成“固相抗體—抗原—檢測(cè)抗體”三明治結(jié)構(gòu)。

酶促顯色反應(yīng)

隨后加入?辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的鏈霉親和素，與生物素檢測(cè)抗體結(jié)合。

最后加入TMB顯色底物，在HRP催化下產(chǎn)生藍(lán)色產(chǎn)物，反應(yīng)終止后變?yōu)辄S色。

濃度定量分析

黃色深淺與樣本中白脂素含量成正比，通過(guò)酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（OD值），

并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算出樣本中白脂素的濃度。

公司正在出售的產(chǎn)品：

1. 基因克隆與表達(dá)載體構(gòu)建

從人類(lèi)FBN1基因C端序列中擴(kuò)增Asprosin編碼片段（約140aa）。

將目的片段插入原核表達(dá)載體，確保帶有?N端或C端His標(biāo)簽，便于后續(xù)純化。

轉(zhuǎn)化至?感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性克隆并測(cè)序驗(yàn)證。

2. 重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)

取陽(yáng)性菌落接種于LB培養(yǎng)基（含氨芐青霉素），37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。

次日按1:100比例轉(zhuǎn)接至新鮮LB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)至OD600達(dá)0.6–0.8。

加入IPTG至終濃度0.1–1.0 mM，16–25℃誘導(dǎo)表達(dá)6–12小時(shí)（低溫誘導(dǎo)有助于可溶性達(dá)）。

4℃、8000×g離心10分鐘收集菌體，棄上清，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3. 菌體裂解與蛋白提取

將菌體沉淀重懸于裂解緩沖液（如PBS + 1% Triton X-100 + 蛋白酶抑制劑），超聲破碎

（冰浴條件下，每次30秒，共6–10次，功率30%）。

4℃、12000×g離心20分鐘，收集上清（可溶性蛋白）或沉淀（包涵體蛋白）。

若為包涵體蛋白，需用?洗滌緩沖液（含2M尿素的PBS）洗滌2–3次，去除雜蛋白。

4. 親和層析純化（Ni-NTA法）

將含His標(biāo)簽的蛋白溶液（或溶解后的包涵體蛋白，使用含6–8M尿素的緩沖液溶解）上樣至?Ni-NTA親和層析柱。

用?洗滌緩沖液（含20–40mM咪唑）洗去非特異性結(jié)合蛋白。

用?洗脫緩沖液（含250–500mM咪唑）梯度洗脫目標(biāo)蛋白，收集洗脫峰。

透析去除尿素與咪唑（使用PBS或生理緩沖液，4℃過(guò)夜，更換3次）。

5. 蛋白復(fù)性（針對(duì)包涵體蛋白）

若蛋白以包涵體形式表達(dá)，需在純化后進(jìn)行?梯度復(fù)性：

將變性蛋白緩慢加入含?梯度降低尿素（6M → 4M → 2M → 0M）的復(fù)性緩沖液中，4℃攪拌過(guò)夜?；虿捎?透析法?逐步去除變性劑。復(fù)性后再次離心取上清，檢測(cè)蛋白活性。