Recombinant Human ME3圖片
該蛋白是一種線粒體NADP?-依賴性蘋果酸酶，在細(xì)胞代謝中發(fā)揮關(guān)鍵作用，催化蘋果酸氧化脫羧生成丙酮酸、NADPH和CO?，為脂肪酸和膽固醇的生物合成提供還原力。ME3與ME1、ME2同屬蘋果酸酶家族，但其活性不受變構(gòu)調(diào)節(jié)，具有相對(duì)穩(wěn)定的四聚體結(jié)構(gòu)。研究表明，ME3在胰腺癌等多種腫瘤中表達(dá)，其特異性抑制劑（如6-哌嗪-1-基吡啶-3-醇酰胺類似物）正在被探索作為潛在的抗癌藥物。
商品介紹：
A-01K101647-50μg | Recombinant Human ME3圖片 |
A-01K101647-200ug | Recombinant Human ME3圖片 |
A-01K101647-1mg | Recombinant Human ME3圖片 |
別稱：Malate dehydrogenase, Malic enzyme 3, Malic enzyme 3, NADP(+) dependent, mitochondrial, NADP ME, NADPME, Pyruvic malic carboxylase
標(biāo)簽：N-terminal His Tag
種屬：Human
宿主：E.Coli
表達(dá)區(qū)間：24-590
分子量：62.3 kDa
Greater than 95% as determined by SDS-PAGE
應(yīng)用：Western Blot, ELISA
性狀：Lyophilized from a 0.2 μm filtered solution in 10 mM Hepes, 500 mM NaCl with 5% trehalose, pH7.4
純度：Greater than 95% as determined by SDS-PAGE
溶解方法:Centrifuge the vial at 10,000 rpm for 1 minute, reconstitute at 200 μg/ml in sterile distilled water by gentle pipetting 2-3 times, don’t vortex
存儲(chǔ):-20°C for 12 months as lyophilized; 2-8°C for 1 month under sterile conditions after reconstitution
檢測(cè)原理詳解：
包被抗體結(jié)合
實(shí)驗(yàn)開始前，微孔板已預(yù)先包被抗人白脂素單克隆抗體。當(dāng)加入待測(cè)樣本后，
樣本中的人白脂素（Asprosin）會(huì)與固相載體上的捕獲抗體特異性結(jié)合。
形成“夾心復(fù)合物”
洗滌去除未結(jié)合物質(zhì)后，加入生物素標(biāo)記的檢測(cè)抗體，該抗體與白脂素分子的另一表位結(jié)合，
形成“固相抗體—抗原—檢測(cè)抗體”三明治結(jié)構(gòu)。
酶促顯色反應(yīng)
隨后加入?辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的鏈霉親和素，與生物素檢測(cè)抗體結(jié)合。
最后加入TMB顯色底物，在HRP催化下產(chǎn)生藍(lán)色產(chǎn)物，反應(yīng)終止后變?yōu)辄S色。
濃度定量分析
黃色深淺與樣本中白脂素含量成正比，通過酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（OD值），
并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣本中白脂素的濃度。
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實(shí)驗(yàn)步驟：
1. 基因克隆與表達(dá)載體構(gòu)建
從人類FBN1基因C端序列中擴(kuò)增Asprosin編碼片段（約140aa）。
將目的片段插入原核表達(dá)載體，確保帶有?N端或C端His標(biāo)簽，便于后續(xù)純化。
轉(zhuǎn)化至?感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆并測(cè)序驗(yàn)證。
2. 重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)
取陽性菌落接種于LB培養(yǎng)基（含氨芐青霉素），37℃振蕩培養(yǎng)過夜。
次日按1:100比例轉(zhuǎn)接至新鮮LB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)至OD600達(dá)0.6–0.8。
加入IPTG至終濃度0.1–1.0 mM，16–25℃誘導(dǎo)表達(dá)6–12小時(shí)（低溫誘導(dǎo)有助于可溶性達(dá)）。
4℃、8000×g離心10分鐘收集菌體，棄上清，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>
3. 菌體裂解與蛋白提取
將菌體沉淀重懸于裂解緩沖液（如PBS + 1% Triton X-100 + 蛋白酶抑制劑），超聲破碎
（冰浴條件下，每次30秒，共6–10次，功率30%）。
4℃、12000×g離心20分鐘，收集上清（可溶性蛋白）或沉淀（包涵體蛋白）。
若為包涵體蛋白，需用?洗滌緩沖液（含2M尿素的PBS）洗滌2–3次，去除雜蛋白。
4. 親和層析純化（Ni-NTA法）
將含His標(biāo)簽的蛋白溶液（或溶解后的包涵體蛋白，使用含6–8M尿素的緩沖液溶解）上樣至?Ni-NTA親和層析柱。
用?洗滌緩沖液（含20–40mM咪唑）洗去非特異性結(jié)合蛋白。
用?洗脫緩沖液（含250–500mM咪唑）梯度洗脫目標(biāo)蛋白，收集洗脫峰。
透析去除尿素與咪唑（使用PBS或生理緩沖液，4℃過夜，更換3次）。
5. 蛋白復(fù)性（針對(duì)包涵體蛋白）
若蛋白以包涵體形式表達(dá)，需在純化后進(jìn)行?梯度復(fù)性：
將變性蛋白緩慢加入含?梯度降低尿素（6M → 4M → 2M → 0M）的復(fù)性緩沖液中，4℃攪拌過夜。或采用?透析法?逐步去除變性劑。復(fù)性后再次離心取上清，檢測(cè)蛋白活性。
關(guān)鍵字： ME3;Human;E.Coli;
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