?產(chǎn)品名稱：西方蜜蜂微孢子蟲PCR檢測(cè)試劑盒
英文名稱：Nosema apisPCR
貨號(hào)：YS-P014523
分類：PCR檢測(cè)試劑盒
規(guī)格?：50T/盒
檢測(cè)原理：
裂解蜜蜂腸道樣本內(nèi)西方蜜蜂微孢子蟲孢子，釋放孢子內(nèi)基因組 DNA 并純化。
引物針對(duì)西方蜜蜂微孢子蟲特有小亞基 rRNA 序列設(shè)計(jì)，特異性極強(qiáng)。
PCR 擴(kuò)增目標(biāo)核酸片段，通過產(chǎn)物檢測(cè)判斷蜜蜂是否感染該微孢子蟲。
實(shí)驗(yàn)流程：
（一）反應(yīng)體系配制（冰上操作，防酶失活與污染）
按 “水→緩沖液→dNTP→引物→模板→Taq 酶” 順序加樣（酶最后加，避免失活）。
輕輕渦旋混勻，短暫離心（3000rpm，10s），使液體沉至管底。
無熱蓋的 PCR 儀：加 1 滴礦物油覆蓋液面，防止蒸發(fā)。
（二）PCR 程序設(shè)置（標(biāo)準(zhǔn) 35 循環(huán)）
預(yù)變性：94℃，3-5min（徹底變性模板 DNA）。
循環(huán)階段（35 次）：
變性：94℃，30s（雙鏈解鏈）。
退火：55-65℃，30s（引物結(jié)合模板，按引物 Tm 值調(diào)整）。
延伸：72℃，1min/kb（Taq 酶合成新鏈，1kb 片段約 1min）。
終延伸：72℃，5-10min（確保片段完整延伸）。
保溫：4℃，∞（防止非特異性復(fù)性，短期保存）。
（三）產(chǎn)物檢測(cè)（瓊脂糖凝膠電泳）
制膠：1% 瓊脂糖凝膠（1g 瓊脂糖 + 100mL 1×TAE 緩沖液），加熱融化后加核酸染料，倒膠插梳，凝固 30min。
上樣：取 5μL PCR 產(chǎn)物 + 1μL 上樣緩沖液，點(diǎn)樣；同時(shí)加 DNA Marker（分子量對(duì)照）。
電泳：120V，20-30min，至溴酚藍(lán)遷移至凝膠 2/3 處。
成像：凝膠成像系統(tǒng)觀察條帶，目標(biāo)片段位置與預(yù)期一致則為陽性。
四、參數(shù)優(yōu)化
退火溫度（Tm）：引物 Tm 值 = 4×(G+C)+2×(A+T)，退火溫度一般低于 Tm 值 5℃，溫度過高無條帶，過低非特異性條帶多。
Mg2?濃度：1.5-2.5mM，濃度過低酶活性低、產(chǎn)量少；過高非特異性擴(kuò)增增加。
循環(huán)數(shù)：25-35 個(gè)循環(huán)，少于 25 個(gè)產(chǎn)物不足，多于 35 個(gè)易出現(xiàn)非特異性條帶。
延伸時(shí)間：按目標(biāo)片段長度調(diào)整，≤1kb 用 1min，1-3kb 用 2-3min。
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注意事項(xiàng)：
試劑禁止反復(fù)凍融，分裝為小體積 - 20℃保存，融化后冰上放置不超過 2 h
所有耗材必須無 DNase/RNase，吸頭一次性使用，廢液、廢棄 PCR 管 121℃高壓滅菌后丟棄
陽性質(zhì)粒高拷貝，開蓋全程在生物安全柜操作，防止氣溶膠污染實(shí)驗(yàn)室
試劑盒僅限科研檢測(cè)，禁止人、臨床樣本檢測(cè)
試劑盒過期、試劑渾濁、變色禁止使用
若大量樣本出現(xiàn)陰性對(duì)照帶污染，立即更換全新試劑盒，徹底紫外消毒實(shí)驗(yàn)臺(tái)面、移液器
關(guān)鍵字： 西方蜜蜂微孢子蟲;PCR檢測(cè)試劑盒;
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