本試劑盒基于雷氏普羅威登斯菌專屬基因序列設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增體系，可專一性檢測(cè)該致病菌核酸，精準(zhǔn)鑒別雷氏普羅威登斯菌引發(fā)的畜禽感染病癥。試劑盒檢測(cè)靈敏度高、擴(kuò)增特異性強(qiáng)，無(wú)雜菌交叉反應(yīng)，適配各類臨床及環(huán)境樣本。主要用于畜禽雷氏普羅威登斯菌感染確診、菌種精準(zhǔn)鑒定、規(guī)?；B(yǎng)殖環(huán)境病原監(jiān)測(cè)及疫病防控。
產(chǎn)品名稱 | 雷氏普羅威登斯菌PCR檢測(cè)試劑盒 | 貨號(hào) | YS-P014645 |
英文名稱 | Providencia rettgeriPCR | 規(guī)格 | 50T |
有效期 | 12個(gè)月 | 保存 | -20℃保存 |
基礎(chǔ)原理：
裂解臨床樣本菌體，提取并純化細(xì)菌 DNA 作為擴(kuò)增模板。
引物靶向雷氏普羅威登斯菌特有序列，避免同屬其他菌株干擾。
讀取擴(kuò)增 Ct 值，Ct 小于閾值即判定樣本存在雷氏普羅威登斯菌。
?操作步驟?：
（一）反應(yīng)體系配制（冰上操作，防酶失活與污染）
按 “水→緩沖液→dNTP→引物→模板→Taq 酶” 順序加樣（酶最后加，避免失活）。
輕輕渦旋混勻，短暫離心（3000rpm，10s），使液體沉至管底。
無(wú)熱蓋的 PCR 儀：加 1 滴礦物油覆蓋液面，防止蒸發(fā)。
（二）PCR 程序設(shè)置（標(biāo)準(zhǔn) 35 循環(huán)）
預(yù)變性：94℃，3-5min（徹底變性模板 DNA）。
循環(huán)階段（35 次）：
變性：94℃，30s（雙鏈解鏈）。
退火：55-65℃，30s（引物結(jié)合模板，按引物 Tm 值調(diào)整）。
延伸：72℃，1min/kb（Taq 酶合成新鏈，1kb 片段約 1min）。
終延伸：72℃，5-10min（確保片段完整延伸）。
保溫：4℃，∞（防止非特異性復(fù)性，短期保存）。
（三）產(chǎn)物檢測(cè)（瓊脂糖凝膠電泳）
制膠：1% 瓊脂糖凝膠（1g 瓊脂糖 + 100mL 1×TAE 緩沖液），加熱融化后加核酸染料，倒膠插梳，凝固 30min。
上樣：取 5μL PCR 產(chǎn)物 + 1μL 上樣緩沖液，點(diǎn)樣；同時(shí)加 DNA Marker（分子量對(duì)照）。
電泳：120V，20-30min，至溴酚藍(lán)遷移至凝膠 2/3 處。
成像：凝膠成像系統(tǒng)觀察條帶，目標(biāo)片段位置與預(yù)期一致則為陽(yáng)性。
四、參數(shù)優(yōu)化
退火溫度（Tm）：引物 Tm 值 = 4×(G+C)+2×(A+T)，退火溫度一般低于 Tm 值 5℃，溫度過(guò)高無(wú)條帶，過(guò)低非特異性條帶多。
Mg2?濃度：1.5-2.5mM，濃度過(guò)低酶活性低、產(chǎn)量少；過(guò)高非特異性擴(kuò)增增加。
循環(huán)數(shù)：25-35 個(gè)循環(huán)，少于 25 個(gè)產(chǎn)物不足，多于 35 個(gè)易出現(xiàn)非特異性條帶。
延伸時(shí)間：按目標(biāo)片段長(zhǎng)度調(diào)整，≤1kb 用 1min，1-3kb 用 2-3min。
?注意事項(xiàng)?：
避免反復(fù)凍融試劑，解凍后需充分混勻。
實(shí)驗(yàn)環(huán)境需嚴(yán)格分區(qū)（試劑準(zhǔn)備區(qū)、樣本處理區(qū)、擴(kuò)增區(qū)），防止污染。
陽(yáng)性對(duì)照需與樣本分裝操作。
本產(chǎn)品僅限科研用途，不可用于臨床診斷。
操作時(shí)需穿戴防護(hù)裝備，避免試劑接觸皮膚或眼睛。
樣本采集需遵循無(wú)菌原則，運(yùn)輸時(shí)使用干冰或冰袋保存。
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