?產(chǎn)品名稱：鏈球菌屬通用PCR檢測(cè)試劑盒
英文名稱：Streptococcus spp.PCR
貨號(hào)：YS-P014792
分類：PCR檢測(cè)試劑盒
規(guī)格?：50T/盒
檢測(cè)原理：
引物靶向鏈球菌屬高度保守的 16S rRNA 基因，可擴(kuò)增屬內(nèi)絕大多數(shù)菌種核酸。
只要樣本存在鏈球菌基因組 DNA 即可啟動(dòng)特異性擴(kuò)增反應(yīng)。
僅能判定樣本檢出鏈球菌屬細(xì)菌，無法直接區(qū)分具體鏈球菌種類。
實(shí)驗(yàn)流程：
（一）反應(yīng)體系配制（冰上操作，防酶失活與污染）
按 “水→緩沖液→dNTP→引物→模板→Taq 酶” 順序加樣（酶最后加，避免失活）。
輕輕渦旋混勻，短暫離心（3000rpm，10s），使液體沉至管底。
無熱蓋的 PCR 儀：加 1 滴礦物油覆蓋液面，防止蒸發(fā)。
（二）PCR 程序設(shè)置（標(biāo)準(zhǔn) 35 循環(huán)）
預(yù)變性：94℃，3-5min（徹底變性模板 DNA）。
循環(huán)階段（35 次）：
變性：94℃，30s（雙鏈解鏈）。
退火：55-65℃，30s（引物結(jié)合模板，按引物 Tm 值調(diào)整）。
延伸：72℃，1min/kb（Taq 酶合成新鏈，1kb 片段約 1min）。
終延伸：72℃，5-10min（確保片段完整延伸）。
保溫：4℃，∞（防止非特異性復(fù)性，短期保存）。
（三）產(chǎn)物檢測(cè)（瓊脂糖凝膠電泳）
制膠：1% 瓊脂糖凝膠（1g 瓊脂糖 + 100mL 1×TAE 緩沖液），加熱融化后加核酸染料，倒膠插梳，凝固 30min。
上樣：取 5μL PCR 產(chǎn)物 + 1μL 上樣緩沖液，點(diǎn)樣；同時(shí)加 DNA Marker（分子量對(duì)照）。
電泳：120V，20-30min，至溴酚藍(lán)遷移至凝膠 2/3 處。
成像：凝膠成像系統(tǒng)觀察條帶，目標(biāo)片段位置與預(yù)期一致則為陽性。
四、參數(shù)優(yōu)化
退火溫度（Tm）：引物 Tm 值 = 4×(G+C)+2×(A+T)，退火溫度一般低于 Tm 值 5℃，溫度過高無條帶，過低非特異性條帶多。
Mg2?濃度：1.5-2.5mM，濃度過低酶活性低、產(chǎn)量少；過高非特異性擴(kuò)增增加。
循環(huán)數(shù)：25-35 個(gè)循環(huán)，少于 25 個(gè)產(chǎn)物不足，多于 35 個(gè)易出現(xiàn)非特異性條帶。
延伸時(shí)間：按目標(biāo)片段長(zhǎng)度調(diào)整，≤1kb 用 1min，1-3kb 用 2-3min。
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注意事項(xiàng)：
避免反復(fù)凍融試劑，解凍后需充分混勻。
實(shí)驗(yàn)環(huán)境需嚴(yán)格分區(qū)（試劑準(zhǔn)備區(qū)、樣本處理區(qū)、擴(kuò)增區(qū)），防止污染。
陽性對(duì)照需與樣本分裝操作。
本產(chǎn)品僅限科研用途，不可用于臨床診斷。
操作時(shí)需穿戴防護(hù)裝備，避免試劑接觸皮膚或眼睛。
樣本采集需遵循無菌原則，運(yùn)輸時(shí)使用干冰或冰袋保存。
關(guān)鍵字： 鏈球菌屬通用;PCR檢測(cè)試劑盒;
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