商品屬性：
產(chǎn)品名稱 | 人肽酰甘氨酸α酰胺化單加氧酶(PAM)活性蛋白 | 型號 | YS-DB3129 |
物種 | Homo sapiens (Human，人) | 用途 | 僅供科研實(shí)驗(yàn) |
型號：YS-DB3129
產(chǎn)品名稱：人肽酰甘氨酸α酰胺化單加氧酶(PAM)活性蛋白
物種：Homo sapiens (Human，人)
英文名稱：Active Peptidylglycine Alpha Amidating Monooxygenase (PAM)
PAL; PHM; Peptidylamidoglycolate lyase; Peptidyl-Alpha-hydroxyglycine Alpha-amidating Lyase; Peptidylglycine Alpha-Hydroxylating Monooxygenase
酶與激酶
物種：Homo sapiens (Human，人)
緩沖液成份：20mM Tris, 150mM NaCl緩沖液（pH8.0, 含有1mM EDTA, 1mM DTT, 0.01% SKL, 5% Trehalose和Proclin300）
性狀：凍干粉
純度：> 95%
等電點(diǎn)：8.8
應(yīng)用：Cellculture;ActivityAssays.
規(guī)格10μg50μg200μg1mg5mg
核心參數(shù)：
體外神經(jīng)肽酰胺化修飾活性檢測，用于內(nèi)分泌肽成熟調(diào)控及 PAM 酶抑制劑篩選。
基礎(chǔ)核心參數(shù)
物種：人；基因 PAM；雙功能氧化酶；分泌途徑囊泡，神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞富集
核心生物功能
神經(jīng)肽、激素 C 端甘氨酸酰胺化修飾，是多肽激素生物活化必需翻譯后修飾
調(diào)控促腎上腺皮質(zhì)激素、催產(chǎn)素、胃腸激素成熟，維持神經(jīng)內(nèi)分泌穩(wěn)態(tài)
使用方法：
1. 蛋白復(fù)溶
解凍：從低溫冰箱取出蛋白后，立即置于冰上緩慢解凍，避免室溫放置導(dǎo)致蛋白變性。
緩沖液選擇：根據(jù)蛋白特性選擇合適的復(fù)溶緩沖液，常用基礎(chǔ)緩沖液為10-50mM Tris-HCl（pH7.0-8.0）或PBS（pH7.2-7.4）；部分蛋白需添加100-300mM NaCl維持滲透壓，或添加1-5mM DTT、β-巰基乙醇等還原劑保持蛋白穩(wěn)定性。
復(fù)溶操作：根據(jù)蛋白濃度，加入適量緩沖液使終濃度達(dá)到0.1-1.0mg/mL（部分難溶蛋白可適當(dāng)調(diào)整濃度）；輕輕顛倒離心管或用移液器緩慢吹打混勻，避免劇烈震蕩；置于冰上靜置10-30分鐘，期間可輕柔混勻2-3次，確保蛋白充分溶解。
2. 活性測定（以酶類蛋白為例）
試劑準(zhǔn)備：根據(jù)酶的催化特性，配制相應(yīng)的底物溶液、輔助因子溶液、反應(yīng)緩沖液等；確保所有試劑均為分析純以上級別，且在有效期內(nèi)。
反應(yīng)體系優(yōu)化：通過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定酶的最適反應(yīng)溫度、pH值、底物濃度、酶濃度等參數(shù)；通常反應(yīng)體系體積為50-200μL，酶濃度需根據(jù)活性高低調(diào)整。
檢測操作：按照優(yōu)化后的反應(yīng)體系依次加入試劑，啟動(dòng)反應(yīng)后，通過分光光度法、熒光法、比色法等檢測方法，實(shí)時(shí)或終點(diǎn)檢測底物消耗、產(chǎn)物生成的信號變化。
活性計(jì)算：根據(jù)檢測到的信號變化值，結(jié)合摩爾消光系數(shù)、熒光量子產(chǎn)率等參數(shù)，計(jì)算酶的活性單位（U）；1U定義為在特定條件下，每分鐘催化1μmol底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的酶量。
3. Western Blot檢測
樣品處理：取適量復(fù)溶后的蛋白溶液，加入等體積的2×SDS上樣緩沖液，沸水浴加熱5-10分鐘使蛋白變性；若蛋白含二硫鍵，可添加β-巰基乙醇或DTT輔助變性。
電泳分離：將變性后的樣品加入SDS-PAGE凝膠的上樣孔，同時(shí)加入蛋白Marker；先以80V電壓運(yùn)行濃縮膠（約30分鐘），待樣品進(jìn)入分離膠后，調(diào)整電壓至120V繼續(xù)電泳（約60-90分鐘），直至蛋白Marker分離清晰。
轉(zhuǎn)膜操作：根據(jù)蛋白分子量選擇合適孔徑的PVDF或NC膜；采用濕轉(zhuǎn)或半干轉(zhuǎn)法將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移至膜上，濕轉(zhuǎn)條件通常為200-300mA電流，轉(zhuǎn)膜時(shí)間60-120分鐘；轉(zhuǎn)膜后可通過麗春紅染色確認(rèn)轉(zhuǎn)膜效果。
封閉與孵育：用5%脫脂牛奶或BSA溶液封閉膜1-2小時(shí)，封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)；加入一抗（按說明書推薦比例稀釋），4℃孵育過夜；次日用TBST緩沖液洗膜3次，每次10分鐘；加入HRP標(biāo)記的二抗（按說明書推薦比例稀釋），室溫孵育1小時(shí)；再次用TBST緩沖液洗膜3次，每次10分鐘。
顯色檢測：將膜浸入ECL化學(xué)發(fā)光試劑中，避光孵育1-5分鐘；使用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)曝光檢測蛋白條帶，根據(jù)條帶位置和灰度分析蛋白表達(dá)情況。
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關(guān)鍵字： 人肽酰甘氨酸α酰胺化單加氧酶;PAM;活性蛋白;
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