本試劑盒采用雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)樣本中人CYP21B含量，微孔板預(yù)先包被純化的抗人CYP21B特異性抗體，加入標(biāo)準(zhǔn)品與待測(cè)樣本后，樣本中的CYP21B抗原與固相抗體特異性結(jié)合，經(jīng)洗滌去除殘留雜質(zhì)，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的CYP21B二抗，形成固相抗體-抗原-酶標(biāo)抗體夾心復(fù)合物，充分反應(yīng)后洗滌去除游離酶標(biāo)抗體，加入TMB底物顯色，酸性溶液終止反應(yīng)后測(cè)定OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算出待測(cè)樣本中CYP21B的精準(zhǔn)含量。
基本參數(shù)?：
產(chǎn)品名稱：人細(xì)胞色素P450c21B/21-羥化酶(CYP21B)ELISA試劑盒
英文名稱：CYP21B Elisa Kit
貨號(hào)：Y-E949
規(guī)格：48T/96T
靈敏度：檢出極限 0.18ng/mL
檢測(cè)范圍：0.4-25.6ng/mL
反應(yīng)時(shí)間：室溫孵育樣本 80min，二抗 65min，避光顯色 18min
保存條件：未拆封 2-8℃；拆封剩余板條密封加干燥劑 2-8℃，不可冷凍凍裂包被板
顯色系統(tǒng)：A 液緩沖體系 + B 液底物組分混合后顯色
檢測(cè)波長(zhǎng)：450nm 為主，600nm 做參考校正背景
標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：四參數(shù)擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線，剔除偏離過大標(biāo)準(zhǔn)孔后計(jì)算最終濃度
注意事項(xiàng)：CYP21B 與 CYP21A 同源性高，樣本不可交叉混用兩套試劑盒，防止非特異性結(jié)合
通用注意事項(xiàng)：
樣本要求
血清、血漿避免嚴(yán)重溶血、脂血、黃疸；組織勻漿充分離心去除沉淀；樣本分裝凍存，反復(fù)凍融≥3 次會(huì)導(dǎo)致抗原降解，檢測(cè)值偏低。
溫度控制
孵育溫度嚴(yán)格 37℃，溫箱溫度波動(dòng)、室溫過低會(huì)降低結(jié)合效率，背景升高、重復(fù)性變差。
避光操作
TMB 底物、酶結(jié)合物、神經(jīng)遞質(zhì) / 維生素類靶標(biāo)樣本見光易氧化，顯色全程避光，試劑避光存放。
洗板規(guī)范
洗滌不充分會(huì)造成高背景、假陽性；拍干時(shí)使用干凈吸水紙，禁止交叉污染微孔。
污染防控
實(shí)驗(yàn)耗材無 DNase、RNase、蛋白酶；槍頭一次性更換，標(biāo)準(zhǔn)品與樣本避免交叉加樣；底物液變色、出現(xiàn)沉淀不可使用。
安全防護(hù)
終止液含稀硫酸，具有腐蝕性，避免接觸皮膚、黏膜；實(shí)驗(yàn)廢液集中收集中和后處理，不可直接傾倒。
失效判定
試劑盒超出有效期、試劑渾濁變色、標(biāo)準(zhǔn)品梯度無明顯顏色差異，均判定失效，禁止繼續(xù)實(shí)驗(yàn)。
稀釋校正
樣本 OD 值高于最高標(biāo)準(zhǔn)孔時(shí)，必須稀釋重測(cè)，最終結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)；低于最低檢測(cè)限標(biāo)注 “低于試劑盒靈敏度”。
空白對(duì)照
空白孔吸光度應(yīng)極低，若空白孔 OD＞0.1，說明洗滌不充分或試劑污染，實(shí)驗(yàn)作廢重做。
儲(chǔ)存禁忌
試劑盒不可冷凍結(jié)冰，冷凍會(huì)造成酶標(biāo)抗體蛋白變性，直接導(dǎo)致試劑盒完全失效。
實(shí)驗(yàn)步驟如下：
試劑盒置于室溫環(huán)境 30min 回溫，配置一步法抗體 - 酶復(fù)合物工作液，劃分實(shí)驗(yàn)孔類型。
每孔先加注酶復(fù)合液 55μL，標(biāo)品孔加梯度 CYP21B 標(biāo)準(zhǔn)液 45μL，樣品孔加待測(cè)樣本 45μL，空白孔加稀釋緩沖液 45μL。
封板膜密封微孔板，37℃孵育 65min，傾倒廢液，洗板 5 次，每次洗滌浸泡 30s，拍干殘余洗液。
每孔加入單一 TMB 顯色液 100μL，水平搖晃微孔板混勻。
遮光條件下 37℃顯色 16min，依據(jù)標(biāo)品顏色深淺判斷顯色程度。
每孔加入終止液 50μL，終止底物催化反應(yīng)。
酶標(biāo)儀 450nm 測(cè) OD，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣本 CYP21B 濃度。
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關(guān)鍵字： 人細(xì)胞色素P450c21B/21-羥化酶;CYP21B;ELISA試劑盒;
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