酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)服務(wù) – 蛋白-蛋白相互作用篩選 / 活細(xì)胞內(nèi)互作驗(yàn)證 / 互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

酵母雙雜交（Yeast Two-Hybrid, Y2H） 是研究蛋白-蛋白相互作用（Protein-Protein Interaction, PPI） 最經(jīng)典、應(yīng)用最廣泛的活細(xì)胞內(nèi)驗(yàn)證與篩選技術(shù)之一。該技術(shù)基于真核轉(zhuǎn)錄因子的模塊化結(jié)構(gòu)特性，在酵母細(xì)胞內(nèi)重建轉(zhuǎn)錄激活系統(tǒng)，以高靈敏度和高特異性檢測目標(biāo)蛋白之間的相互作用。本公司提供從酵母文庫構(gòu)建、文庫篩選、點(diǎn)對點(diǎn)互作驗(yàn)證到互作圖譜繪制的全流程一站式酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)服務(wù)，覆蓋核蛋白酵母雙雜交系統(tǒng)與膜蛋白酵母雙雜交系統(tǒng)（分裂泛素系統(tǒng)） 兩大體系，廣泛應(yīng)用于信號通路解析、蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建、新互作蛋白發(fā)現(xiàn)、藥物靶點(diǎn)篩選及功能基因組學(xué)研究等領(lǐng)域。

服務(wù)技術(shù)原理

酵母雙雜交系統(tǒng)的核心基于真核生物轉(zhuǎn)錄因子的模塊化結(jié)構(gòu)特性。以經(jīng)典的GAL4轉(zhuǎn)錄因子為例，其包含兩個(gè)功能上相互獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域：DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DNA-Binding Domain, BD） 和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（Activation Domain, AD）。BD負(fù)責(zé)識別并結(jié)合報(bào)告基因上游的DNA激活序列（UAS），AD負(fù)責(zé)激活報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄。當(dāng)BD與AD在物理空間上分離時(shí)，單獨(dú)存在均不能激活報(bào)告基因表達(dá)；只有當(dāng)兩者在空間上相互靠近時(shí)，才能重建完整的轉(zhuǎn)錄因子活性，啟動(dòng)下游報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄。

酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)的基本策略是：將目標(biāo)蛋白X（誘餌蛋白，Bait） 與BD結(jié)構(gòu)域融合表達(dá)，將待研究蛋白Y（獵物蛋白，Prey） 或cDNA文庫編碼的蛋白與AD結(jié)構(gòu)域融合表達(dá)。當(dāng)?shù)鞍譞與蛋白Y在酵母細(xì)胞內(nèi)發(fā)生相互作用時(shí)，BD與AD在空間上相互靠近，重建功能性轉(zhuǎn)錄因子，激活下游報(bào)告基因（如HIS3、ADE2、LacZ等）的轉(zhuǎn)錄。通過營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基篩選（如缺組氨酸、缺腺嘌呤）或顯色反應(yīng)（如X-gal顯色），即可直觀判斷蛋白之間是否存在相互作用。

根據(jù)目標(biāo)蛋白的亞細(xì)胞定位不同，酵母雙雜交系統(tǒng)主要分為兩大體系：

核蛋白酵母雙雜交系統(tǒng)（Nuclear Y2H） ：適用于可溶性蛋白、核蛋白的相互作用研究。該系統(tǒng)基于GAL4轉(zhuǎn)錄因子重建原理，是最經(jīng)典、應(yīng)用最廣泛的Y2H體系。

膜蛋白酵母雙雜交系統(tǒng)（Membrane Y2H / Split-Ubiquitin System） ：適用于膜蛋白、跨膜蛋白的相互作用研究。該系統(tǒng)采用分裂泛素（Split-Ubiquitin） 技術(shù)，將泛素分為N端（Nub）和C端（Cub）兩部分，分別與目標(biāo)蛋白融合。當(dāng)膜蛋白之間發(fā)生相互作用時(shí)，Nub與Cub在空間上靠近并重構(gòu)為完整泛素，被泛素特異性蛋白酶（UBPs）識別并切割，釋放人工轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)入細(xì)胞核激活報(bào)告基因。

主要服務(wù)內(nèi)容

酵母文庫構(gòu)建：根據(jù)客戶提供的樣本（細(xì)胞、組織等），提取高質(zhì)量Total RNA并分離mRNA；通過SMART技術(shù)或Gateway技術(shù)合成雙鏈cDNA；將cDNA與酵母雙雜交載體（如pGADT7、pGBKT7等）進(jìn)行重組連接；轉(zhuǎn)化大腸桿菌后構(gòu)建高質(zhì)量cDNA文庫，庫容量可達(dá)10?個(gè)以上獨(dú)立克隆，插入率>95%，平均片段長度>1000 bp；提供初級文庫菌液和次級文庫質(zhì)粒等多形式交付；

誘餌載體構(gòu)建與質(zhì)控：將客戶提供的目標(biāo)基因（誘餌基因）克隆至酵母雙雜交BD載體（如pGBKT7）；通過測序驗(yàn)證序列正確性；進(jìn)行自激活檢測——評估誘餌蛋白是否單獨(dú)激活報(bào)告基因（若存在自激活需優(yōu)化截短方案）；進(jìn)行毒性檢測——評估誘餌蛋白對酵母細(xì)胞生長的影響；

酵母雙雜交文庫篩選：將誘餌載體與cDNA文庫共轉(zhuǎn)化至酵母感受態(tài)細(xì)胞（如Y2HGold、AH109等酵母菌株）；涂布于營養(yǎng)缺陷型篩選培養(yǎng)基（如SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade等）進(jìn)行初篩；對陽性克隆進(jìn)行復(fù)篩驗(yàn)證（如更高嚴(yán)謹(jǐn)度的營養(yǎng)缺陷篩選或X-gal顯色）；從陽性克隆中提取質(zhì)粒，測序鑒定插入片段；通過BLAST比對分析確定互作蛋白的基因身份；

點(diǎn)對點(diǎn)酵母雙雜交驗(yàn)證：針對已知的兩個(gè)目標(biāo)蛋白，將誘餌載體與獵物載體共轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞；通過營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基和X-gal顯色雙重報(bào)告基因系統(tǒng)驗(yàn)證互作；設(shè)置嚴(yán)格對照體系——空載體對照（排除自激活）、陽性對照（已知互作對驗(yàn)證體系有效性）、陰性對照（排除非特異性互作）；

互作圖譜繪制（可選） ：基于文庫篩選獲得的大量陽性克隆數(shù)據(jù)，構(gòu)建蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖譜；結(jié)合生物信息學(xué)分析進(jìn)行GO功能注釋、KEGG通路富集及網(wǎng)絡(luò)可視化；

Y2H-seq高通量篩選（可選） ：將文庫篩選獲得的陽性克隆進(jìn)行高通量測序（Y2H-seq） ，實(shí)現(xiàn)全基因組范圍的互作蛋白定量分析，假陽性率低于5%。

典型應(yīng)用場景

新互作蛋白的發(fā)現(xiàn)與篩選：以目標(biāo)蛋白為誘餌，從cDNA文庫中高通量篩選與其相互作用的未知蛋白，發(fā)現(xiàn)新信號通路成員；

已知蛋白互作的驗(yàn)證與確認(rèn)：驗(yàn)證兩個(gè)已知蛋白之間是否存在直接相互作用，是Co-IP、GST Pull-Down等體外互作發(fā)現(xiàn)后的關(guān)鍵體內(nèi)驗(yàn)證手段；

蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建：通過系統(tǒng)性的酵母雙雜交篩選，繪制特定物種、組織或信號通路相關(guān)的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖譜；

互作結(jié)構(gòu)域/關(guān)鍵氨基酸定位：通過誘餌蛋白的系列截短突變體或點(diǎn)突變體，精確定位介導(dǎo)相互作用的最小結(jié)構(gòu)域及關(guān)鍵氨基酸殘基；

藥物靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)與PPI抑制劑篩選：篩選與疾病相關(guān)靶點(diǎn)蛋白相互作用的候選蛋白，為藥物開發(fā)提供新靶點(diǎn)；

信號通路與功能基因組學(xué)研究：解析細(xì)胞增殖、分化、凋亡、應(yīng)激響應(yīng)等生理過程中的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)；

抗原-抗體相互作用研究：研究抗體與抗原的識別與結(jié)合機(jī)制。

服務(wù)優(yōu)勢（為什么選擇我們）

雙體系全覆蓋：同時(shí)提供核蛋白酵母雙雜交系統(tǒng)和膜蛋白酵母雙雜交系統(tǒng)（分裂泛素系統(tǒng)） ，覆蓋胞漿蛋白、核蛋白及膜蛋白等全部蛋白類型；

高靈敏度，可檢測弱/瞬時(shí)相互作用：在酵母活細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行檢測，能夠捕捉微弱和瞬時(shí)的蛋白質(zhì)相互作用，靈敏度遠(yuǎn)高于許多體外方法；

生理環(huán)境模擬，結(jié)果真實(shí)可靠：在真核酵母細(xì)胞內(nèi)檢測蛋白互作，更接近天然生理狀態(tài)，避免了體外實(shí)驗(yàn)可能引入的構(gòu)象變化；

高通量篩選能力：cDNA文庫庫容量達(dá)10?個(gè)以上獨(dú)立克隆，單次篩選可覆蓋全基因組范圍，大幅提高發(fā)現(xiàn)新互作蛋白的效率；

嚴(yán)格質(zhì)控與多重對照體系：每項(xiàng)實(shí)驗(yàn)標(biāo)配自激活檢測、空載體對照、陽性對照、陰性對照全套質(zhì)控，確保結(jié)果真實(shí)可靠；

一站式全流程服務(wù)：客戶僅需提供樣本或目標(biāo)基因信息，我們完成從RNA提取、文庫構(gòu)建、文庫篩選、點(diǎn)對點(diǎn)驗(yàn)證到數(shù)據(jù)交付的整套服務(wù)；

豐富項(xiàng)目經(jīng)驗(yàn)：已成功完成5000+ 篩選項(xiàng)目，覆蓋40余個(gè)物種，包括人類、水稻、玉米、小麥、擬南芥等；

知識產(chǎn)權(quán)歸客戶所有：篩選獲得的新互作蛋白及序列信息完全歸客戶所有，我們承諾嚴(yán)格保密。

樣本要求與交付周期

樣本類型    要求    備注

目標(biāo)基因信息    提供基因ID、CDS序列或蛋白名稱    用于誘餌載體構(gòu)建

組織樣本（文庫構(gòu)建）    動(dòng)物組織≥1 g；植物組織≥1-4 g；細(xì)胞≥10?個(gè)    用于Total RNA提取

Total RNA（文庫構(gòu)建）    ≥200 μg，RIN≥7    干冰運(yùn)輸

誘餌質(zhì)粒（客戶提供）    ≥2 μg，含目標(biāo)基因    用于自激活檢測及文庫篩選

獵物質(zhì)粒/基因信息（點(diǎn)對點(diǎn)驗(yàn)證）    提供獵物基因序列或質(zhì)粒    用于點(diǎn)對點(diǎn)互作驗(yàn)證

交付周期：

cDNA文庫構(gòu)建：4~6周

文庫篩選（含誘餌構(gòu)建+自激活檢測+篩選）：6~8周

點(diǎn)對點(diǎn)驗(yàn)證：2~3周

Y2H-seq高通量篩選：8~10周

交付內(nèi)容：

cDNA文庫菌液及文庫質(zhì)粒（文庫構(gòu)建項(xiàng)目）；

陽性克隆酵母菌液及質(zhì)粒（含測序結(jié)果及BLAST比對分析）；

點(diǎn)對點(diǎn)驗(yàn)證結(jié)果報(bào)告（含報(bào)告基因顯色圖片、生長情況記錄）；

完整實(shí)驗(yàn)報(bào)告（含載體構(gòu)建、自激活檢測、篩選條件、對照設(shè)置等詳細(xì)記錄）；

互作圖譜及生物信息學(xué)分析報(bào)告（可選）；

實(shí)驗(yàn)結(jié)論及結(jié)果解讀建議。

常見問題（FAQ）

Q：酵母雙雜交與Co-IP、GST Pull-Down有什么不同？如何選擇？

A：三者均為研究蛋白互作的重要手段，但各有側(cè)重。酵母雙雜交是在酵母活細(xì)胞內(nèi)檢測蛋白互作，能夠反映生理狀態(tài)下的真實(shí)互作，且靈敏度高，可檢測弱/瞬時(shí)相互作用；同時(shí)支持高通量文庫篩選，一次性發(fā)現(xiàn)大量新互作蛋白。Co-IP和GST Pull-Down為體外/離體實(shí)驗(yàn)，用于驗(yàn)證已知蛋白對或在酵母雙雜交發(fā)現(xiàn)后進(jìn)行交叉驗(yàn)證。一般建議：若處于早期探索階段、尚不清楚目標(biāo)蛋白的互作伙伴，首選酵母雙雜交文庫篩選；若已有明確候選互作對，三種方法均可，但酵母雙雜交是體內(nèi)驗(yàn)證的金標(biāo)準(zhǔn)。

Q：核蛋白酵母雙雜交和膜蛋白酵母雙雜交如何選擇？

A：選擇取決于目標(biāo)蛋白的亞細(xì)胞定位——核蛋白酵母雙雜交適用于可溶性蛋白、核內(nèi)蛋白及胞漿蛋白的互作研究；膜蛋白酵母雙雜交（分裂泛素系統(tǒng)） 專門針對膜蛋白、跨膜蛋白設(shè)計(jì)，能夠在膜環(huán)境中檢測蛋白互作。若您的目標(biāo)蛋白為膜蛋白（如受體、離子通道等），必須選擇膜體系；若為可溶性蛋白，選擇核體系即可。

Q：什么是自激活？如何解決？

A：自激活是指誘餌蛋白（BD-目標(biāo)蛋白融合體）單獨(dú)存在時(shí)即能激活報(bào)告基因表達(dá)，導(dǎo)致假陽性結(jié)果。自激活通常源于目標(biāo)蛋白本身具有轉(zhuǎn)錄激活活性。我們通過以下策略解決：①自激活檢測——在轉(zhuǎn)化誘餌載體后，涂布不同嚴(yán)謹(jǐn)度的營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基，評估自激活水平；②截短優(yōu)化——對目標(biāo)蛋白進(jìn)行系列截短，去除具有轉(zhuǎn)錄激活活性的區(qū)域；③更換系統(tǒng)——必要時(shí)切換至更嚴(yán)謹(jǐn)?shù)慕湍妇昊驁?bào)告基因系統(tǒng)。

Q：酵母雙雜交篩選的假陽性率如何控制？

A：我們通過多維度策略控制假陽性：①多重報(bào)告基因系統(tǒng)——同時(shí)使用營養(yǎng)缺陷型報(bào)告基因（如HIS3/ADE2）和顯色報(bào)告基因（LacZ），只有同時(shí)激活多個(gè)報(bào)告基因的克隆才被認(rèn)定為陽性；②嚴(yán)格對照體系——空載體對照、陰性對照、陽性對照全程并行；③復(fù)篩驗(yàn)證——初篩陽性克隆需經(jīng)過復(fù)篩確認(rèn)；④回轉(zhuǎn)驗(yàn)證——將陽性克隆的獵物質(zhì)粒重新轉(zhuǎn)化，與誘餌進(jìn)行點(diǎn)對點(diǎn)驗(yàn)證；⑤Y2H-seq定量分析——通過高通量測序?qū)﹃栃钥寺∵M(jìn)行定量分析，假陽性率可控制在5%以下。

Q：文庫構(gòu)建需要多少樣本？樣本質(zhì)量有什么要求？

A：文庫構(gòu)建對樣本質(zhì)量要求較高——?jiǎng)游锝M織≥1 g，植物組織≥1-4 g（葉片組織≥4 g，根莖或種子≥8 g），細(xì)胞≥10?個(gè)。樣本需液氮速凍后-80℃保存，干冰運(yùn)輸。若直接提供Total RNA，需≥200 μg，RIN≥7。高質(zhì)量的起始樣本是構(gòu)建高質(zhì)量文庫的關(guān)鍵保障。

Q：酵母雙雜交能否用于研究蛋白與核酸的相互作用？

A：酵母雙雜交專門用于蛋白-蛋白相互作用研究。如需研究蛋白-DNA相互作用（如轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子結(jié)合），請參考我們的酵母單雜交（Yeast One-Hybrid, Y1H） 服務(wù)。

Q：能否提供Y2H-seq高通量篩選服務(wù)？

A：可以。我們提供Y2H-seq高通量篩選服務(wù)——將文庫篩選獲得的陽性克隆進(jìn)行高通量測序，實(shí)現(xiàn)全基因組范圍的互作蛋白定量分析。該服務(wù)尤其適合需要系統(tǒng)繪制蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)的大規(guī)模研究項(xiàng)目。

6個(gè)核心關(guān)鍵詞

酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)服務(wù) —— 服務(wù)全稱核心詞，客戶最直接的搜索入口

蛋白-蛋白相互作用篩選 —— 服務(wù)的核心應(yīng)用，覆蓋互作蛋白發(fā)現(xiàn)與驗(yàn)證需求

酵母雙雜交文庫篩選 —— 覆蓋cDNA文庫構(gòu)建與高通量篩選的核心需求

點(diǎn)對點(diǎn)酵母雙雜交驗(yàn)證 —— 長尾關(guān)鍵詞，覆蓋已知蛋白互作驗(yàn)證的精準(zhǔn)搜索

膜蛋白酵母雙雜交 —— 覆蓋膜蛋白互作研究的 specialized 需求

蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)分析 —— 上位學(xué)術(shù)詞匯，覆蓋互作圖譜繪制與系統(tǒng)生物學(xué)研究需求

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