IPTG介紹

 IPTG是β–半乳糖苷酶的活性誘導物質(zhì)。藍白斑篩選中，IPTG作為安慰性誘導物誘導細菌內(nèi)的蛋白表達，X-gal作為生色底物。其原理為IPTG可誘導載體Lac操縱子DNA區(qū)段合成β-半乳糖苷酶氨基端片段，該片段可與宿主細胞編碼的缺陷型β-半乳糖苷酶實現(xiàn)基因內(nèi)互補（α互補），實現(xiàn)α互補的細菌鋪在含有X-gal生色底物的培養(yǎng)基上，可形成藍色菌落；而外源DNA插入質(zhì)粒的多克隆位點后，可破壞α互補作用，培養(yǎng)基上將長出白色菌落。IPTG也是常用的基因工程中重組蛋白表達的誘導劑。

IPTG的誘導原理

（1）在原核蛋白表達體系中，如 E.coli的乳糖操縱子（元）含Z、Y及A三個結(jié)構(gòu)基因，分別編碼半乳糖苷酶、滲透酶和乙?；D(zhuǎn)移酶，此外還有一個操縱序列O、一個啟動序列P及一個調(diào)控基因I。I基因編碼一種阻遏蛋白（Lac阻遏物，不屬于乳糖操縱子），后者與O序列結(jié)合，使操縱子（元）受阻遏而處于關(guān)閉狀態(tài)。在啟動序列P上游還有一個分解（代謝）物基因激活蛋白（CAP）結(jié)合位點。由P序列、O序列和CAP結(jié)合位點共同構(gòu)成lac操縱子的調(diào)控區(qū)，三個酶的編碼基因即由同一調(diào)控區(qū)調(diào)節(jié)，實現(xiàn)基因產(chǎn)物的協(xié)調(diào)表達 。

（2）Lac 阻遏物是一種具有 4 個相同亞基的四級結(jié)構(gòu)蛋白，都有一個與誘導劑結(jié)合的位點。 在沒有乳糖存在時，Lac操縱子（元）處于阻遏狀態(tài)。此時，I序列在PI啟動序列操縱下表達的Lac阻遏蛋白與O序列結(jié)合，阻礙RNA聚合酶與P序列結(jié)合，抑制轉(zhuǎn)錄啟動。當有乳糖存在時，Lac操縱子（元）即可被誘導。在這個操縱子（元）體系中，真正的誘導劑并非乳糖本身。乳糖進入細胞，經(jīng)β-半乳糖苷酶催化，轉(zhuǎn)變?yōu)榘肴樘恰瓷砩系恼T導劑。后者作為一種誘導劑分子結(jié)合阻遏蛋白，使蛋白構(gòu)象變化，導致阻遏蛋白與O序列解離、RNA 聚合酶不再受阻礙，啟動子P 開始發(fā)生轉(zhuǎn)錄，啟動反應開始發(fā)生轉(zhuǎn)錄。

IPTG的優(yōu)點：

1.能誘導酶的合成，但又不被分解的分子，稱為安慰誘導物。由于乳糖雖可誘導酶的合成，但又隨之分解，產(chǎn)生很多復雜的動力學問題，因此人們常用安慰誘導物來進行各種實驗。

2.IPTG不被菌體代謝，為乳糖類似物，一旦進入細胞就會產(chǎn)生持續(xù)長久的誘導效果，所以IPTG的誘導效率高，往往只需要很少量(1mmol/L)即可達到理想誘導效果。由于IPTG不被代謝，在胞內(nèi)專一誘導外源蛋白的表達。不受細胞代謝的影響，誘導效果持續(xù)穩(wěn)定。乳糖有雙效作用，既能做為誘導劑異乳糖的前體物質(zhì)，又可以做碳源，在誘導過程中，很不穩(wěn)定，IPTG因其優(yōu)異的穩(wěn)定性決定了它適合做實驗研究用。

3.IPTG能在缺乏lacY基因下而有效地被抄送。

4.半乳糖苷鍵中用硫代替了氧，失去了水解活性，但硫代半乳糖苷和同源的氧代化合物與酶位點的親和力相同，IPTG雖不為β–半乳糖苷酶所識別，但它是lac基因簇十分有效的誘導物。