名稱 RIPA裂解液(弱) | RIPA Lysis Buffer (Mild)
規(guī)格 100ml
存儲 -20℃保存，一年有效。盡量避免反復(fù)凍融，建議分裝后使用。


產(chǎn)品描述 

RIPA裂解液(RIPA Lysis Buffer)，其本意是Radio Immunoprecipitation Assay，是一種傳統(tǒng)的細胞組織快速裂解液，對動物細胞胞膜、胞漿、胞核成分均有裂解作用。根據(jù)其裂解液的強度不同，大致可以分為強、中、弱三類。

本品為較為溫和的裂解液（即RIPA裂解液（弱）），含有sodium orthovanadate，sodium fluoride，EDTA，leupeptin等多種抑制劑，可以有效抑制蛋白降解。裂解得到的蛋白樣品可用于常規(guī)的Western、IP等實驗。

注意事項 

1）需自備PMSF。
2）裂解樣品的所有步驟都需在冰上或4℃進行。
3）用RIPA裂解液裂解得到的蛋白樣品，可以用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定其蛋白濃度。由于含有較高濃度的去垢劑，不能用Bradford法測定由本裂解液裂解得到樣品的蛋白濃度。
4）為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

使用說明 

(一) 細胞樣品

1）融解RIPA裂解液，混勻。取適當(dāng)量的裂解液，在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入PMSF，使PMSF的最終濃度為1mM。

2）貼壁細胞：去除培養(yǎng)液，用PBS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液洗一遍(如果血清中的蛋白沒有干擾，可以不洗)。按照6孔板每孔加入150-250μl 裂解液的比例加入裂解液。用槍吹打數(shù)下，使裂解液和細胞充分接觸。通常裂解液接觸細胞1-2秒后，細胞就會被裂解。

懸浮細胞：離心收集細胞，用手指把細胞用力彈散。按照6孔板每孔細胞加入150-250μl 裂解液的比例加入裂解液。再用手指輕彈以充分裂解細胞。充分裂解后應(yīng)沒有明顯的細胞沉淀。如果細胞量較多，必需分裝成50-100萬細胞/管，然后再裂解。

3）充分裂解后，10000-14000g離心3-5分鐘，取上清，即可進行后續(xù)的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

裂解液用量說明：通常6孔板每孔細胞加入150μl裂解液已經(jīng)足夠，但如果細胞密度非常高可以適當(dāng)加大裂解液的用量到200μl或250μl。

（二）組織樣品：

1）把組織剪切成細小的碎片。

2）融解RIPA裂解液，混勻。取適當(dāng)量的裂解液，在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入PMSF，使PMSF的最終濃度為1mM。

3）按照每20mg組織加入150-250μl裂解液的比例加入裂解液。(如果裂解不充分可以適當(dāng)添加更多的裂解液，如果需要高濃度的蛋白樣品，可以適當(dāng)減少裂解液的用量。)

4）用玻璃勻漿器勻漿，直至充分裂解。

5）充分裂解后，10000-14000g離心3-5分鐘，取上清，即可進行后續(xù)的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。


6）如果組織樣品本身非常細小，可以適當(dāng)剪切后直接加入裂解液裂解，通過強烈vortex使樣品裂解充分。然后同樣離心取上清，用于后續(xù)實驗。直接裂解的優(yōu)點是比較方便，不必使用勻漿器，缺點是不如使用勻漿器那樣裂解得充分。


【注】：RIPA裂解液的裂解產(chǎn)物中經(jīng)常會出現(xiàn)一小團透明膠狀物，屬正常現(xiàn)象。該透明膠狀物為含有基因組DNA等的復(fù)合物。在不檢測和基因組DNA結(jié)合特別緊密的蛋白的情況下，可以直接離心取上清用于后續(xù)實驗；如果需要檢測和基因組結(jié)合特別緊密的蛋白，則可以通過超聲處理打碎打散該透明膠狀物，隨后離心取上清用于后續(xù)實驗。如果檢測一些常見的轉(zhuǎn)錄因子，例如NF-kappaB、p53等時，通常不必進行超聲處理，就可以檢測到這些轉(zhuǎn)錄因子。