Alamar Blue 檢測(cè)試劑為細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性檢測(cè)提供了一種簡(jiǎn)便、快速、可靠、安全的方法，適用于高通量檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。該檢測(cè)試劑的主要成分是一種氧化還原指示劑。其在氧化狀態(tài)下呈現(xiàn)紫藍(lán)色無(wú)熒光性，而在還原狀態(tài)下，轉(zhuǎn)變?yōu)槌史奂t或紅色熒光的還原產(chǎn)物，吸收峰為530-560nm，而散射峰為590nm。在細(xì)胞增殖過(guò)程中，細(xì)胞內(nèi)NADPH/NADP、 FADH/FAD、 FMNH/FMN 和NADH/NAD 的比值升高，處于還原環(huán)境。攝入細(xì)胞內(nèi)的染料被這些代謝中間體及細(xì)胞色素類(lèi)還原后釋放到細(xì)胞外并溶于培養(yǎng)基中，使培養(yǎng)基從無(wú)熒光的靛青藍(lán)變成有熒光的粉紅色。最后用普通分光光度計(jì)或熒光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)，吸光度和熒光強(qiáng)度與活性細(xì)胞數(shù)成正比。
操作說(shuō)明：
1. 在100 微升細(xì)胞懸液中加入10 微升的檢測(cè)試劑，在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2-6 小時(shí)，培養(yǎng)基的顏色由靛青藍(lán)開(kāi)始變成粉紅色就可以進(jìn)入下一步。
2. 推薦使用熒光酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)，激發(fā)光波長(zhǎng)在530-560 nm 之間，發(fā)射光波長(zhǎng)為590 nm，記錄相對(duì)熒光單位(RFU)。
3. 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線或細(xì)胞生長(zhǎng)曲線：縱座標(biāo)(Y 軸)為相對(duì)熒光單位(RFU);橫坐標(biāo)(X 軸)為細(xì)胞數(shù)或時(shí)間點(diǎn)或藥物濃度。
注意事項(xiàng)：
1. 合適密度的細(xì)胞可以增加檢測(cè)靈敏度。對(duì)于96 孔板，我們建議每孔接種100 微升細(xì)胞，細(xì)胞濃度范圍為：貼壁細(xì)胞在100-10,000/孔，懸浮細(xì)胞在2,000-50,000/孔，并以培養(yǎng)基為空白對(duì)照。對(duì)于384 孔板，細(xì)胞濃度和接種量均減半。
2. 整個(gè)過(guò)程均應(yīng)為無(wú)菌操作，因?yàn)槲⑸镂廴疚锿瑯涌梢赃€原檢測(cè)試劑而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
3. 注意接種細(xì)胞濃度和加入檢測(cè)試劑后孵育時(shí)間。細(xì)胞濃度過(guò)高或孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)導(dǎo)致繼發(fā)性還原反應(yīng)，產(chǎn)生無(wú)色和熒光消失。
4. 孵育時(shí)，須避光。
5. 本產(chǎn)品可以使用熒光或分光光度檢測(cè)，但熒光的靈敏度高，實(shí)驗(yàn)誤差小，推薦使用熒光檢測(cè)。