超級雜交液（含甲酰胺）

產(chǎn)品及特點

 核酸雜交一般是指用一種標記的核酸探針與印跡膜上的核酸進行雜交，由此檢測印跡膜上是否存在與探針同源的核酸分子（靶分子）。核酸雜交是分子生物學的基本技術之一，應用非常廣泛。由于核酸雜交效率受印跡膜種類、雜交溫度、探針濃度、雜交液離子強度、雜交液 pH 及雜交液粘度等因素影響，用戶自己摸索和優(yōu)化相關條件非常繁瑣，因此本公司開發(fā)了本產(chǎn)品，它具有下列特點：

1. 既可用于 Southern 雜交（靶分子為 DNA），也可用于和 Northern 雜交（靶分子為 RNA），還可以用于菌落雜交，基因芯片等雜交。

2. 既可以用于同位素探針的雜交，也可以用于非同位素探針的雜交。

3. 既可以使用 DNA（包括 DNA Oligo）探針，也可以使用 RNA 探針（包括 RNA Oligo）

4. 含多種能夠促進雜交的聚合物，使雜交反應能在 6~12 小時完成，而常規(guī)雜交反應一般需要 12~24 小時。

5. 含多種封堵劑，能阻印跡膜對探針分子的非特異性吸附，能有效降低背景信號，延長曝光時間以便檢測到低拷貝的 RNA（Northern）和單拷貝的基因（Southern）。

6. A 型不含甲酰胺，B 型含 50%的甲酰胺。后者使雜交在較低溫度就可以完成，適合 Tm 較高的分子雜交（如 RNA-RNA 和 RNA-DNA 雜交）。

7. 跟各種常用的印跡膜兼容，包括硝酸纖維素膜和尼龍膜。
 

運輸及保存 低溫運輸，-20℃保存，有效期一年。本產(chǎn)品屬于高鹽溶液，低溫下產(chǎn)生沉淀，必須在 65℃加熱溶解并充分搖勻后才能使用。

自備試劑 印跡膜、標記探針、6×SSC、2×SSC、0.1×SSC

使用方法 一、根據(jù)探針和靶分子的不同，分別按下面不同情況計算雜交分子的 Tm 值

1. 對 DNA-DNA 雜交，其 Tm = 81.5 + 16.6×log10[Na+] + 0.41×GC%–500/L

說明：L 是探針或靶分子的長度（用兩者中最短的一個）GC%是探針或靶分子中的 GC 百分比（用兩者中最短的一個）Na+濃 度 是 本 產(chǎn) 品 中 Na+ 的 濃 度 ， 為 0.75 M， 16.6×log10[Na+]=（-2.07）

2. 對 DNA-RNA 雜交，其 Tm 值比 DNA-DNA 的 Tm 值要高 10-15℃。

3. 對 RNA-RNA 雜交，其 Tm 值比 DNA-DNA 的 Tm 值要高 20-25℃。

4. 對 Oligo 探針雜交，Tm=GC 數(shù)量×4℃+AT 數(shù)量×2℃。

二、確定雜交溫度（預雜交溫度跟雜交溫度應該一樣）

1. 對于大于 200bp 的 DNA-DNA 雜交，雜交溫度一般比 Tm 低15-25℃，一般選擇 68℃。

2. 對 RNA-RNA 或 DNA-RNA 雜交，雜交溫度一般比 Tm 低15-25℃。如果這樣計算出的雜交溫度很高（如高于 70℃ ），則 RNA容易降解，所以選用含甲酰胺的超級雜交液（B 型本產(chǎn)品），以便能在 42℃完成雜交。

3. 對 Oligo 探針的雜交，雜交溫度一般比 Tm 低 5℃。由于 Oligo較短，更容易受各種因素影響（如錯配率、修飾堿基比例等），所以溫度需要適度摸索和優(yōu)化。

三、確定洗膜溫度

一般使用 0.1×SSC 做洗膜液，在此條件下的洗膜溫度比 Tm 低5-12℃，一般情況下可以在 55℃進行洗膜。Oligo 探針可以室溫洗膜。

四、預雜交步驟

預雜交就是用不含探針的本產(chǎn)品跟印跡膜進行孵育，其目的是用所含的非特異性 DNA 分子(鮭精 DNA 或小牛胸腺 DNA)及其它高分子化合物將印跡膜上會非特異地吸附探針分子的位點封閉，否則這些位點會吸附標記的探針，造成高背景。

1. 將結合了靶分子的硝酸纖維素印跡膜或尼龍印跡膜浸泡于自備的 6×SSC 溶液中，使其充分濕潤。

2. 將濕潤的印跡膜置于一塑料雜交袋中（塑料袋預先封口，再剪掉一角，留一個小口），按每平方厘米印跡膜加 0.2 mL 超級雜交液的比例沿小口加入超級雜交液，然后用塑料封口機將口封牢。

3. 將此塑料袋浸沒入溫度設定在雜交溫度的恒溫水浴中或雜交爐中，保溫 1-2 小時，延長到 12-16 小時亦可。注意保溫過程中塑料袋應在不停的搖動狀態(tài)中，使超級雜交液與印跡膜充分接觸。

五、雜交步驟

1. 如果標記的探針是雙鏈核酸，則需經(jīng)變性處理。具體操作是將探針樣品在沸水浴中加熱 5 分鐘，然后迅速置冰浴中。如果是單鏈 DNA 或RNA 探針，則不需變性，直接使用。

2. 將單鏈探針或變性后的雙鏈探針加入到完成了預雜交的雜交袋中（先用剪刀剪一小口，加入探針后用熱封機封口）。探針的加入量視探針標記效率而定，一般要求終濃度不能低于 1-2 ng/mL。如果檢測基因組中的單拷貝基因，探針的加入量應加大，而對于檢測克隆的基因片段，則探針的量可減少。如果是放射性探針，應將此塑料袋套在另一塑料袋之中，以避免雜交袋發(fā)生遺漏、污染工作環(huán)境。

3. 在選定的雜交溫度下繼續(xù)保溫，時間一般為 6-12 小時。

六、洗膜步驟。注意在下面的所有操作過程中，一定不要使印跡膜干燥。此步是將與印跡膜非特異結合的探針分子洗去而只留下特異結合的探針分子。由于非特異性雜交的雜交分子解鏈溫度較低，熱穩(wěn)定性較差，在一定的溫度和較低的離子強度下，即可洗掉。

1. 雜交完畢，取出塑料袋，剪去一角，倒出所有的含探針的雜交液。此含探針的雜交液可以多次使用再倒棄。

2. 剪開雜交袋，用鑷子取出印跡膜，浸沒于大量的 2×SSC（含 0.5 %SDS）溶液中，室溫下振蕩漂洗 15 分鐘。

3. 重復上步操作一次。

4. 將印跡膜轉(zhuǎn)移至 0.1×SSC（含 0.1% SDS）溶液中，在計算好的洗膜溫度下振蕩漂洗 30 分鐘至 1 小時。

5. 重復上步操作一次。如果是同位素標記探針，則需要重復至用蓋革計數(shù)器在無核酸區(qū)域檢測不出放射信號為止。

6. 將印跡膜轉(zhuǎn)移到濾紙上，吸去表面液體后印跡膜即可用于后續(xù)檢測。