一站式His標記蛋白質微量純化套裝
產品及特點基于 His-Ni 親和層析的蛋白質純化方法是目前分離純化重組表達蛋白質的重要方法，本產品就是專門用于上述實驗的一站式產品，具有下列特點：

1. 一站式套裝，含所需的介質、溶液和層析柱，用戶只需要提供表達 His 蛋白的細菌（酵母、桿狀病毒、培養(yǎng)細胞）即可，非常方便。

2. 專一性強，一次過柱即可獲得純度高達 95%的 His-標記蛋白。

3. 變性和非變性條件均可使用，也適用于純化包涵體中的 His 標記蛋白。

4. 每次可以處理 20 mL 的表達菌液，適合初步篩選和鑒定。

5. 提供 4 mL 濃度為 50%的 Ni-Agarose 介質，其載量為 20-30 mg His標記蛋白質/mL 介質。

6. 介質為 CL-6B 瓊脂糖，含四個 Ni 離子螯合基團，比只有四個 Ni 離子螯合基團的 Ni-IDA 更有效。

7. 本介質可以反復使用多次。
一站式His標記蛋白質微量純化套裝
規(guī)格及成分 成份 編 號 小扁盒包裝
Ni-Agarose 介質，50% 100102 4 mL
1 M 咪唑溶液 100102a 25 mL
1 M Tris-HCl 溶液，pH7.9 100102b 25 mL
5 M NaCl 溶液 25-06290 25 mL
溶菌酶（20KU/mg） 80103c 30 mg(黃蓋)
Benzonase 溶液（2U/uL） 100102c 20 uL(紅蓋)
鹽酸胍 50-01-1 6 g
尿素 57-13-6 20 g
PMSF 溶液（10mg/mL） 100833 0.5 mL(白蓋)
親和層析柱，6 mL 110809 1 套
使用手冊 1 份 1 份

一站式His標記蛋白質微量純化套裝運輸及保存 常溫運輸和保存，但介質長期需 4℃保存，溶菌酶、Benzonase 溶液和 PMSF 溶液需-20℃保存，有效期一年

自備試劑 去離子水、20%乙醇、針頭過濾器（0.45 μm）

使用方法

1. 將 Ni-Agarose 介質充分混勻后，取適量加入到預放了一片篩板的層析柱中

（介質用量需要根據(jù) His 蛋白產量決定，其載量為 20-30 mg His 標記

蛋白質/mL 介質，請根據(jù)實驗需要取適量的 Ni-Agarose 介質加入層析柱）。

2. 用 5 倍柱體積（指填料的體積，下同）自備去離子水洗柱，共三次。

3. 用 5 倍柱體積的新配結合液洗柱（配方如下，以 10 mL 為例），共三次：

成分 用量 在結合緩沖液中的濃度

1 M Tri-HCl（pH7.9） 0.2 mL 20 mM

1 M 咪唑溶液 0.1 mL 10 mM

5 M NaCl 溶液 1 mL 500 mM

自備去離子水 8.7 mL -

4. 室溫 5000 g 離心 10 分鐘收集 20 mL 表達菌液，棄上清，沉淀（約 100 mg）

放冰上待用或放-80℃保存。用不加誘導物的菌液做對照樣。

5. 如果超聲破碎細菌：加入 1 mL 冰浴的結合液（1 mL 菌液需要用 50 uL 結

合液），再加入 25 uL PMSF（10 mg/mL）溶液，冰上超聲裂解菌體直到

在顯微鏡下看見絕大多數(shù)細胞破裂。超聲參數(shù)需根據(jù)儀器型號自行摸索，但

裂解物必須不粘稠，否則會堵塞層析柱。如果酶法裂解細菌：加入 1 mL 冰

浴的含溶菌酶的結合液（先取 20 mL 結合液，加入所有 30 mg 溶菌酶干粉，

溶解后分裝成 1 mL/管，剩余的-20℃放置），再加入 25 uL PMSF（10

mg/mL）溶液和 1 uL Benzonase，冰上放置 30 分鐘。

6. 4℃下 13000-15000 g 離心 10 分鐘，去除殘留細胞和細胞碎片以防堵柱，

收集上清，留樣做 SDS-PAGE 電泳對照。如果要純化裂解液中可溶部分的

His 標記蛋白，則直接進入第 7 步；如果要純化裂解液中包涵體（沉淀部分）

中的 His 標記蛋白，則直接進入第 12 步。

A、純化細胞裂解液中可溶部分的 His 標記蛋白

7. 將上步得到的上清液上柱，讓重力使裂解液自然流出。如要提高 His 標記蛋

白與介質的結合效率，可用試劑盒提供的紅蓋將層析柱下的漏液口堵上，讓

細菌裂解液和介質在 4℃結合 30 分鐘或過夜。

8. 用 10 倍柱體積結合液洗柱（配方見上表），收集并保存穿透液（含雜質或沒

被吸附的 His 標記蛋白，可做 SDS-PAGE 電泳的對照）。

9. 如果用一步式洗脫法（適合已經(jīng)找到咪唑濃度的情況），則直接用適量

的新鮮配制的洗脫液洗柱，收集并保存穿透液（含 His 標記蛋白）。洗脫液

的配方如下（以 1 mL 體積和咪唑濃度是 500 mM 為例）：

成分 用量 在洗脫液中的濃度

1 M Tri-HCl （pH7.9） 20 uL 20 mM

1 M 咪唑溶液 500 uL 500 mM

5 M NaCl 溶液 100 uL 500 mM

自備去離子水 380 uL -

10.如果用多步式洗脫（適合不知道咪唑濃度或一步式洗脫雜質多的情況），

則按上表配制一系列咪唑濃度不同（如 40、60、100、200、300 和 500

mM），其他成分濃度不變的洗液，按從低到高的順序洗滌并收集樣品，

SDS-PAGE 電泳檢測 His 標記蛋白所在的區(qū)域。

11.洗脫后，依次使用10 倍柱體積的去離子水洗滌柱子，再用 3倍柱體積的20%

乙醇平衡（乙醇要將填料浸沒），最后堵住層析柱下端的漏口，4℃保存待下

次使用。

B、純化包涵體中 His 標記蛋白

12.將第 6 步離心得到的包涵體沉淀重懸于 1-3 mL 含鹽酸胍結合液中或 1-3

mL 含尿素結合液中（建議優(yōu)先使用尿素做變性劑，因為得到的洗脫液可以

直接跑 SDS-PAGE，而用鹽酸胍的洗脫液需先除鹽后才能電泳）。冰浴 1 小

時以使包涵體溶解，期間可輕柔搖晃幾次。含變性劑的結合液配方如下（以

10 mL 為例）：

成分 含鹽酸胍結合液 含尿素結合液

1M Tri-HCl（pH 7.9） 200 uL 200 uL

5M NaCl 溶液 1 mL 1 mL

鹽酸胍（MW=95.6） 5.7 g 無

尿素（MW=60.1） 無 4.8 g

自備去離子水 加水到 10 mL 加水到 10 mL

13.室溫 10000×g 離心 20 分鐘，沉淀為未溶解的包涵體。將上清（含溶解后

的 His 標記蛋白）以自備的針頭過濾器（0.45 μm）過濾。

14.將濾過液上柱，后續(xù)純化步驟同第 7-第 11 步。只是所用結合液和洗脫液均

含變性劑，含變性劑的洗脫液配方見下表（以 1 mL 為例）：

成分 含鹽酸胍洗脫液 含尿素洗脫液

1M Tri-HCl（pH7.9） 20 uL 20 uL

1M 咪唑溶液 500 uL 500 uL

5M NaCl 溶液 100 uL 100 uL

鹽酸胍（MW=95.6） 0.57 g 無

尿素（MW=60.1） 無 0.48 g

自備去離子水 補水到 1 mL 補水到 1 mL