可保種型藍白T載體

產(chǎn)品及特點 本產(chǎn)品(曾用名:一站式藍白 T 載體)是環(huán)狀的可以制備藍白 T 載體的質(zhì)粒 DNA。T 載體是克隆 PCR 擴增產(chǎn)物的必不可少的工具，但是由于市場上的各種T 載體質(zhì)量參差不齊，用戶很難購買到滿意的產(chǎn)品；同時購買的 T 載體為線性DNA，不能保種，必須反復購買，累計成本很高。為解決這一問題，基因特推出可保種型 T 載體，用戶只需要購買 Xcm I 內(nèi)切酶就可以自己制備高質(zhì)量的 T載體，隨用隨配，十分方便。

1. 一次購買，終身擁有。本產(chǎn)品提供制備 T 載體用的環(huán)形質(zhì)粒 DNA，可以象其他質(zhì)粒一樣保種并長期保存。

2. 隨用隨配，十分方便。用戶只需要提供 Xcm I 限制性內(nèi)切酶和基本分子生物學實驗條件，就可以自己制備 T 載體。整個過程只要兩天。

3. T 載體含 T 率為 100。本方法不是使用傳統(tǒng)的加尾法，而是使用 Xcm I 酶切法。質(zhì)粒的多克隆位點上預先插入了一段長為 1.3 Kb 的 Xcm I DNA 片段,經(jīng) Xcm I 酶切后回收得到的質(zhì)粒 DNA（T 載體）兩端自然全部帶有 T 突出，

比例遠遠高于用 Taq DNA 聚合酶加尾法和 TdT 加尾法得到的 T 載體。

4. 方便各種下游操作。用本產(chǎn)品得到的藍白 T 載體插入位點兩側(cè)有多種常見的酶切位點，便于后續(xù)克??； Xcm I 位點在 Alpha 互補區(qū)，可以使用藍白斑篩選重組子；兩邊還有 T7 和 SP6 RNA 聚合酶啟動子，便于制備 RNA 探針
規(guī)格及成分 成 份 編 號A 型塑料袋包裝B 型塑料袋包裝
藍白 T 載體(環(huán)狀) LM60803a 50 ng 50 ng
Xcm I (5U/uL) LM60803b 無 20 uL
Xcm I Buffer, 10X LM60803c 無 0.3 mL
使用手冊 60803sc 1 份 1 份

運輸及保存 低溫運輸，-20℃保存，有效期兩年

自備試劑 連接反應試劑

使用方法 一. 細菌的轉(zhuǎn)化

1. 將100 μL感受態(tài)細胞于冰上解凍。注意：好使用end A1菌種（如DH1、

DH5、DH5?、JM109、XL1-Blue等。常用宿主細菌的基因型可以參考

《分子克隆手冊》等參考書）。因為這類細菌所含DNase少，制備T載體后，殘留的DNase對的T末端的破壞機會更小。

2. 取5-10 μL本產(chǎn)品加入到感受態(tài)細胞中，輕輕旋轉(zhuǎn)幾次以混勻內(nèi)容物。在冰上放置30分鐘。

3. 將管放入預加溫到42℃的水浴中，熱休克90秒。快速將管轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細胞冷卻1~2分鐘。

4. 每管中加900 μL LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1小時。

5. 取100 μL培養(yǎng)液涂布到含Amp的LB瓊脂平板表面。

6. 將平板置于室溫直至液體被吸收。

7. 倒置平皿，于37℃培養(yǎng)，12~16小時后可出現(xiàn)菌落。

二. 細菌的鑒定

1. 挑取單個菌落進行過夜細菌培養(yǎng)。

2. 按常規(guī)的方法進行質(zhì)粒小量制備。

3. 用Xcm I內(nèi)切酶按下面條件酶切提取的質(zhì)粒DNA，如果大規(guī)模酶切，需要

按比例增加各成分用量:

成分 使用量

Xcm I Buffer, 10X 5 uL

質(zhì)粒DNA <或= 2 ug

Xcm I 1 uL

超純水 加到50uL

 37℃保溫一小時, 65℃保溫20分鐘使酶失活。

4. 電泳，本產(chǎn)品被Xcm I酶切后將產(chǎn)生3 Kb和1.3 Kb的兩段DNA。

5. 如果Xcm I酶切圖譜正確，則按常規(guī)的方法進行細菌的保種（詳見分子克隆手冊等參考書）。

三. T載體的制備

1. 參考《分子克隆手冊》等參考書培養(yǎng)細菌和提取質(zhì)粒DNA。注意：一定要去盡可能去除殘留的RNA和蛋白質(zhì)（含殘留DNase）的污染。

2. 用Xcm I酶切質(zhì)粒。注意：酶切時間好不要超過一小時，避免殘留的DNase對T末端的破壞。

3. 電泳后切下含3Kb DNA（既藍白T載體）的膠段。注意：千萬不要用UV照射將要回收的片段，因為UV會使DNA交連，使DNA失去轉(zhuǎn)化細菌的能力。如果酶切的DNA量大，可以使用基因綠如藍核酸染料,可以直接在可見光和黑背景下切膠。如果別無選擇，好在長波（360nm）紫外燈下快速切膠，盡可能切掉多余的凝膠。為避免DNA交連，可以使用基因的DNA防護劑UV Erasol（CAT#：60601）

4. 用常規(guī)DNA回收方法進行膠回收。

5. 測定T載體DNA的濃度后，將T載體DNA保存在-20℃?zhèn)溆没蛑苯邮褂谩?/p>

四. 連接反應

1. 短暫離心裝有T載體的離心管。

2. 在兩個離心管中加入下列成分：

成份 樣品管 陰性對照管

T4 Ligase Buffer，10X 1 uL 1 uL

藍白 T 載體 20-50 ng 20-50 ng

PCR 純化產(chǎn)物 50-500 ng 不加

T4 Ligase 3-5 U 3-5 U

補水到 10 uL 10 uL

注意: PCR純化產(chǎn)物與藍白T載體的摩爾比好為3:1-10:1。

3. 用移液器吹打連接反應使之混勻后，16℃孵育12小時(或按T4 Ligase供貨商提供的操作手冊進行連接)。

五. 細菌轉(zhuǎn)化和鑒定

1. 取5 μL連接產(chǎn)物進行轉(zhuǎn)化，具體步驟見本手冊一，好使用含X-gal、IPTG、Amp的LB瓊脂平板以便進行藍白篩選。

2. 按經(jīng)典的質(zhì)粒提取+酶切或測序鑒定，可以選用的、在插入位點兩側(cè)都有酶切位點的酶有BstZ I、EcoR I和Not I。可以使用pUC/M13 Forward和Reverse測序引物測定插入片段的序列。按菌落PCR方法篩選，可選用基因的菌落PCR試劑盒（CAT#：50901）進行快速篩選，需要T7和SP6 RNA聚合酶啟動子引物。