BeyoRT™ cDNA鏈合成試劑盒(RNase H-)

BeyoRT™ cDNA鏈合成試劑盒(RNase H-)，即BeyoRT™ First Strand cDNA Synthesis Kit(RNase H minus)是一種采用了經(jīng)過改造和優(yōu)化的BeyoRT™ M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶(RNase H-)，用于在總RNA、mRNA等RNA模板的基礎(chǔ)上反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生
cDNA鏈的試劑盒。本試劑盒包含了進行cDNA鏈合成所需的各種試劑。
采用本試劑盒可以合成長達13kb的cDNA鏈。在采用BeyoRT™ M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶(RNase H-)的情況下，由于缺失了RNase H，RNA和DNA雙鏈復(fù)合物中的RNA不會被降解，這樣反轉(zhuǎn)錄出來的cDNA的長度就會更長，并且產(chǎn)量更高。
試劑盒中提供了RNase Inhibitor，確保在反轉(zhuǎn)錄過程中的RNA不會被RNA酶所降解并取得較好的反轉(zhuǎn)錄效果。
試劑盒還提供了Oligo(dT)₁₈和random hexamer這兩種引物，前者適合用于帶有Poly(A)尾的mRNA的反轉(zhuǎn)錄，后者進行反轉(zhuǎn)錄時不需要poly(A)尾。也可以自行采用基因特異性引物進行cDNA鏈的合成。
試劑盒中提供的Control Primer為17聚，即引物的長度為17個堿基。試劑盒中提供的Control RNA為帶有3’poly(A)的
1.1kb RNA。
使用本試劑盒合成的鏈，可以直接用于后續(xù)的常規(guī)PCR、real-time PCR、cDNA第二條鏈的合成等。
本試劑盒用于體積為20微升的cDNA鏈合成反應(yīng)時足夠進行10個cDNA鏈樣品的合成。
包裝清單：

保存條件：
-20℃保存。
注意事項： 
對于GC含量比較高的RNA的反轉(zhuǎn)錄，試劑盒的使用說明中給予了特別說明，請予以關(guān)注。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。 
 

使用說明：
1. cDNA條鏈的合成(First-strand cDNA Synthesi)：
a. 參考如下表格設(shè)置反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：

*To 13.7μl表示加入DEPC-treated Water至最終體積為13.7μl。
70℃孵育5分鐘并且隨后冰浴冷卻，這樣可以使RNA模板的二級結(jié)構(gòu)充分打開。
b. 輕輕混勻(可以用Vortex在最低速度輕輕混勻或用移液器吹打混勻)，隨后離心沉淀液體。
c. 如果使用Oligo(dT)₁₈作為引物或使用基因特異性引物，在42℃孵育60分鐘。如果使用random hexamer(隨機六聚體)作為引物，先在25℃孵育10分鐘，隨后在42℃孵育60分鐘。
注意：對于GC含量比較高的RNA模板的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，可以設(shè)置為45℃孵育60分鐘。
d. 70℃孵育10分鐘以失活BeyoRT™ M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶(RNase H-)并終止反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。
說明：對于長片斷的cDNA不推薦采用加熱的方法失活BeyoRT™ M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶(RNase H-)，這種操作可能會導(dǎo)致部分長片斷DNA被剪切。
e. 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可以直接用于后續(xù)的PCR等反應(yīng)，也可以-20℃凍存以備以后使用。用于后續(xù)PCR反應(yīng)時，如果PCR的反應(yīng)體系為50微升，則推薦使用2微升反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
2. 其他用途請自行參考M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶(RNase H-)的相關(guān)文獻資料進行。
常見問題：
1. RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物電泳觀察不到。
反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物由于是從模板反轉(zhuǎn)錄而獲得，而模板的量本身比較低，反轉(zhuǎn)錄的量通常還要少于模板量，因此通常RNA的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物直接電泳觀察是觀察不到的。
2. 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物通過PCR擴增沒有特異性條帶。
PCR擴增沒有獲得特異性條帶時建議先使用actin、GAPDH等作為內(nèi)參進行PCR擴增，看是否可以成功擴增。如果可以成功，則說明PCR擴增體系沒有問題，此時通常是目的基因的引物設(shè)計欠佳，當(dāng)然也有可能是反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物質(zhì)量欠佳。如果內(nèi)參不能被很好地擴增，則有可能PCR體系存在問題或反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物質(zhì)量欠佳。