Annexin V-PE/7-AAD雙染細胞凋亡檢測試劑盒

中文名稱：Annexin V-PE/7-AAD雙染細胞凋亡檢測試劑盒

英文名稱：Annexin V-PE/7-AAD Apoptosis Detection Kit

產品規(guī)格：10T|20T|50T|100T

本試劑盒可應用于培養(yǎng)細胞凋亡檢測（不推薦用于檢測組織樣本）。

在正常細胞中，磷脂酰絲氨酸（PS）只分布在細胞膜脂質雙層的內側，而在細胞凋亡早期，細胞膜中的磷脂酰絲氨酸（PS）由脂膜內側翻向外側。Annexin V是一種分子量為35～36kD的Ca²⁺依賴性磷脂結合蛋白，與磷脂酰絲氨酸有高度親和力，故可通過細胞外側暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細胞的胞膜結合。因此Annexin V被作為檢測細胞早期凋亡的靈敏指標之一。將Annexin V進行熒光素PE標記，以標記了的Annexin V作為熒光探針，利用熒光顯微鏡或流式細胞儀可檢測細胞凋亡的發(fā)生。

7-AAD（7-amino-actinomycin D）是一種核酸染料，它不能通過正常質膜，隨著細胞凋亡、細胞死亡過程，質膜對7-AAD的通透性逐漸增加，結合細胞凋亡中DNA的有控降解，在合適波長激發(fā)光的激發(fā)下可發(fā)出明亮的紅色熒光，通過7-AAD標記DNA的強弱，將細胞分為三群：7-AAD強為死亡細胞，7-AAD弱是凋亡細胞，7-AAD-為正?；盍毎?。7-AAD同PI有著相似的熒光特性，但其發(fā)射波譜較PI窄，對其他檢測通道的干擾更小，在多色熒光分析中是PI的替代品，可與Annexin V-PE聯(lián)合使用。

試劑盒組成：
 

保存條件：2～8℃避光，有效期1年。

試劑盒以外自備儀器和試劑
流式細胞儀或熒光顯微鏡、低速離心機、微量移液器、1.5mL Microtube、載玻片、蓋玻片（熒光顯微鏡觀察需用）、PBS、不含EDTA的胰酶消化液

使用注意事項：
1．微量試劑取用前請離心集液。
2．Annexin V-PE/7-AAD避光保存及使用。
3．7-AAD為潛在致癌物，操作時請采取防護措施，穿防護服、戴手套等。
4．本試劑盒適用于檢測活細胞，流式細胞儀檢測時，細胞數量不以應低于1×10⁵，不推薦用于檢測組織樣本。
5．推薦使用懸浮培養(yǎng)細胞。如果是貼壁細胞，建議適用不含EDTA的胰酶消化，如消化不當，可能引起假陽性，而用細胞刮子會造成細胞粘連成團，而影響檢測?？蓪⒁让赶蠹毎谋４嬖诤?%BSA的PBS中，防止進一步的損傷。
6．細胞固定后可能導致熒光的淬滅，請不要固定樣品。
7．因檢測細胞的類型、凋亡誘導劑種類、使用的檢測儀器不同，因而流式檢測的熒光補償也不同，因此建議每次檢測均需使用未經凋亡誘導處理的細胞作為對照，進行熒光補償的調節(jié)。

操作方法：

1．懸浮細胞離心（2000rpm離心5min）收集；貼壁細胞用不含EDTA的胰酶消化收集；
  注：胰酶消化時間不易過長，否則容易引起假陽性。
2．用PBS洗滌細胞二次（2000rpm離心5min）收集1~5×10⁵細胞；
3．在50μL的Binding Buffer中加入5μL 7-AAD染液，混勻；
4．收集細胞中加入上述7-AAD染液，混勻；室溫、避光、反應5～15min；
5．反應后再加入450μL的Binding Buffer混勻；
6．加入1μL Annexin V-PE混勻；室溫、避光、反應5～15min；
7．請在1小時內，進行下述熒光顯微鏡或流式細胞儀的觀察和檢測。

A．熒光顯微鏡觀察
1．滴一滴上述染色后的細胞懸液于載玻片上，并用蓋玻片蓋上細胞；
2．對于貼壁細胞來說，也可直接用蓋玻片來培養(yǎng)細胞并誘導細胞凋亡；
① 將細胞于蓋玻片上生長，用適當的凋亡誘導劑誘導細胞凋亡，并設立陰性對照組；
② 用PBS洗滌細胞兩次；
③ 在500μL的Binding Buffer中加入1μL Annexin V-PE，5μL 7-AAD染液混勻；
④ 將上述溶液滴加于蓋玻片表面，使長有細胞的蓋玻片表面均勻覆蓋；
⑤ 避光、室溫反應5min。
3．將蓋玻片倒置于載玻片上，于熒光顯微鏡下濾光片（羅丹明）觀察Annexin V-PE熒光信號呈橙紅色；激發(fā)波長546nm，發(fā)射波長647nm，觀察7-AAD熒光信號呈紅色。

B．流式細胞儀分析
1．用流式細胞儀檢測，激發(fā)波長Ex=488nm;發(fā)射波長Em=578nm，Annexin V-PE的橙紅色熒光建議使用FL2通道檢測；激發(fā)波長Ex=546nm;發(fā)射波長Em=647nm，7-AAD紅色熒光建議使用FL3通道檢測。
2．熒光補償調節(jié)：使用經凋亡誘導處理的正常細胞，作為對照進行熒光補償調節(jié)去除光譜重疊和設定十字門的位置。

特別提示：本公司的所有產品僅可用于科研實驗，嚴禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！