BRafV600E (IC50 = 0.6 nM); CRAF (IC50 = 5 nM); B-Raf (IC50 = 5.2 nM)

在 Raf 激酶選擇性方面，達(dá)拉非尼對 B-Raf 的偏好程度超過 91% 的其他測試激酶的 400 倍。 Dabrafenib 通過最初將特異性編碼 B-RafV600E 突變的癌細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯在 G1 期，減少 ERK 磷酸化并抑制細(xì)胞增殖。 [1]

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BRAF抑制劑GSK2118436（Dabrafenib）和PLX4032（vemurafenib）的臨床試驗結(jié)果顯示了令人鼓舞的反應(yīng)率；然而，響應(yīng)的持續(xù)時間是有限的。為了確定對GSK2118436獲得性耐藥性的決定因素和克服耐藥性的策略，我們從A375 BRAFV600E和YUSIT1 BRAFV600K黑色素瘤細(xì)胞系中分離出GSK2118443耐藥克隆。這些克隆對變構(gòu)絲裂原激活蛋白/細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（MEK）抑制劑GSK1120212（曲美替尼）的敏感性也降低。這些克隆的遺傳特征表明，在BRAFV600E背景中存在MEK1的框內(nèi)缺失（MEK1K59del）或NRAS突變（NRASQ61K和/或NRASA146T），有和沒有MEK1P387S，BRAFV600K背景中有NRASQ618K。用短發(fā)夾RNA穩(wěn)定敲除NRAS部分恢復(fù)了突變NRAS克隆中GSK2118436的敏感性，而A375親本細(xì)胞中NRASQ61K或NRASA146T的表達(dá)降低了對Dabrafenib/GSK2118436敏感性。同樣，表達(dá)MEK1K59del而非MEK1P387S會降低A375細(xì)胞對GSK2118436的敏感性。GSK2118436和GSK1120212的組合有效地抑制了抗性克隆中的細(xì)胞生長，降低了ERK磷酸化，降低了細(xì)胞周期蛋白D1蛋白，增加了p27kip1蛋白。此外，GSK2118436或GSK1120212與磷酸肌醇3-激酶/mTOR抑制劑GSK2126458的組合增強(qiáng)了這些克隆中的細(xì)胞生長抑制作用，降低了S6核糖體蛋白磷酸化。我們的結(jié)果表明，NRAS和/或MEK突變在體外導(dǎo)致BRAF抑制劑耐藥性，GSK2118436和GSK1120212的組合克服了這種耐藥性。此外，這些抗性克隆對GSK2126458與GSK2118436或GSK1120212的組合有反應(yīng)。臨床試驗正在進(jìn)行或計劃測試這些組合。[2]

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GSK2118436/Dabrafenib（12）在酶和細(xì)胞機(jī)制測定以及B-RafV600E驅(qū)動的黑色素瘤系SKMEL28和A375P F11（IC50=3和8 nM）和結(jié)直腸癌系Colo205（IC50=7 nM）的細(xì)胞增殖測定中顯示出令人信服的抑制活性。令人欣慰的是，GSK2118436在體外對具有野生型B-Raf的細(xì)胞（HFF IC50=3.0μM）和不攜帶激活性B-RafV600E突變的腫瘤細(xì)胞的影響很小[3]。

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GSK2118436/Dabrafenib針對一組61種激酶進(jìn)行了篩選，這些激酶代表了激酶組的廣泛覆蓋范圍，被發(fā)現(xiàn)是B-RafV600E、野生型B-Raf和c-Raf的強(qiáng)效生化抑制劑，顯示出亞納米或納摩爾的效力（見支持信息）。重要的是，還發(fā)現(xiàn)GSK2118436具有高度選擇性，與篩選的大多數(shù)激酶相比，對B-RafV600E的選擇性超過500倍。11在面板中觀察到單個激酶Alk5的顯著活性（<100倍選擇性）。通過測量HepG2細(xì)胞中SMAD2/3的下游磷酸化水平，進(jìn)一步研究了Alk5酶活性對細(xì)胞信號傳導(dǎo)的影響。12在細(xì)胞環(huán)境中，與抑制ERK磷酸化（IC50=4 nM）相比，GSK2118436在抑制SMAD2/3磷酸化方面的效果明顯較差（IC50=3.7μM）。這些數(shù)據(jù)強(qiáng)調(diào)了這種獨特有效和選擇性的B-RafV600E抑制劑所實現(xiàn)的顯著選擇性。[3]

Dabrafenib（口服）可抑制在免疫缺陷小鼠皮下生長的 B-RafV600E 突變結(jié)腸癌 (Colo205) 和黑色素瘤 (A375P) 人類腫瘤異種移植物的發(fā)育。 [1]

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還對GSK2118436/Dabrafenib進(jìn)行了體內(nèi)研究，發(fā)現(xiàn)它能顯著降低攜帶B-RafV600E人類黑色素瘤的小鼠的腫瘤生長。在該模型中，攜帶A375P F11（B-RafV600E）腫瘤的CD1-nu/nu小鼠口服GSK2118436，劑量為0.1、1、10和100mg/kg，每日一次，持續(xù)14天（圖3）。觀察到腫瘤生長的劑量成比例減少。還測量了體重，在任何測試劑量下都沒有觀察到顯著變化。值得注意的是，在100mg/kg組中，50%的受試動物腫瘤完全消退。[3]

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此外，GSK2118436/Dabrafenib在單次口服劑量后以劑量依賴的方式降低了A375P F11（B-RafV600E）腫瘤組織中pERK的水平。在給藥后2、6和24小時收集腫瘤，測量每個腫瘤中的pERK水平，并將其歸一化為存在的總ERK（tERK）。使用MEK抑制劑PD0325901作為對照。圖4顯示了pERK/tERK水平與載體處理動物的水平的比較，以及兩項單獨研究的藥代動力學(xué)數(shù)據(jù)。給藥后2小時和6小時，pERK/tERK水平顯著降低，在這項單劑量研究中，當(dāng)劑量≥3 mg/kg時，藥效作用顯著（抑制率>50%），當(dāng)劑量≤30 mg/kg時，24小時后恢復(fù)到未經(jīng)治療的水平。研究過程中血液和腫瘤中測得的藥物濃度與觀察到的藥效作用相關(guān)。這些數(shù)據(jù)表明，在測試條件下，單次口服劑量≥3 mg/kg的Dabrafenib/GSK2118436可以在至少6小時內(nèi)保持≥50%的B-Raf抑制。[3]

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Raf激酶通過細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2（ERK1/2）發(fā)出信號，以驅(qū)動細(xì)胞分裂。由于BRAF的激活突變（B-Raf原原癌基因，絲氨酸/蘇氨酸激酶）是高度致癌的，因此已開發(fā)出用于癌癥的BRAF抑制劑，包括Dabrafenib。用于癌癥的ERK1/2信號抑制劑在一些患者中具有心臟毒性，這就提出了達(dá)巴芬尼是否具有心臟毒性的問題。在心臟中，ERK1/2信號傳導(dǎo)不僅促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大，具有心臟保護(hù)作用，還促進(jìn)纖維化。我們的假設(shè)是，ERK1/2信號傳導(dǎo)在非應(yīng)激心臟中不是必需的，但在心臟重塑中是必需的。因此，dabrafenib可能會在高血壓等情況下影響心臟。在心肌細(xì)胞、心臟成纖維細(xì)胞和灌注大鼠心臟的實驗中，Dabrafenib抑制ERK1/2信號傳導(dǎo)。我們評估了Dabrafenib（3 mg/kg/d）對雄性C57BL/6J小鼠心臟的體內(nèi)影響。Dabrafenib單獨使用對心臟功能/尺寸（通過超聲心動圖評估）或心臟結(jié)構(gòu)沒有明顯影響。在用0.8mg/kg/d血管緊張素II（AngII）治療以誘導(dǎo)高血壓的小鼠中，dabrafenib在急性（長達(dá)7d）和慢性（28d）情況下抑制ERK1/2信號傳導(dǎo)并抑制心肌肥大，從而保持射血分?jǐn)?shù)。在細(xì)胞水平上，dabrafenib抑制了AngII誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大，降低了肥大基因標(biāo)志物的表達(dá)，幾乎完全消除了間質(zhì)和血管周圍區(qū)域心臟纖維化的增加。Dabrafenib沒有明顯的心臟毒性。此外，它還能抑制由AngII誘導(dǎo)的高血壓引起的適應(yīng)不良肥大。因此，Raf是高血壓心臟病的潛在治療靶點，而針對癌癥開發(fā)的藥物如Dabrafenib可用于此目的[4]。

生化和細(xì)胞分析。[3]
B-Raf生化酶和細(xì)胞測定的詳細(xì)信息已在參考文獻(xiàn)6中報道。Dabrafenib對61種蛋白激酶的抑制作用在葛蘭素史克公司進(jìn)行了表征。一般來說，這些測定被配置為使IC50值接近Dabrafenib對每種酶的內(nèi)在結(jié)合常數(shù)（Ki或Kd），因此可以比較對這些激酶的選擇性。A375P-F11測定：通過有限稀釋將A375P細(xì)胞鋪在96孔板中，收獲單細(xì)胞衍生的克隆，并測試其對B-Raf抑制劑的敏感性。F11克隆被選為未來研究的對象，命名為A375P-F11。測定抗TGF-β活性的細(xì)胞pSmad試驗：在HepG2細(xì)胞中通過機(jī)械試驗測試化合物的活性。將細(xì)胞以500000個細(xì)胞/孔的密度接種在12孔板中，并在37℃/5%CO2下粘附過夜。去除培養(yǎng)基（BME+10%血清），在37℃/5%CO2下將無血清培養(yǎng)基中的化合物加入細(xì)胞中45分鐘。用1ng/ml TGF-β刺激細(xì)胞60分鐘。將細(xì)胞在緩沖液（25 mM Tris-HCl ph:7.5，2 mM EDTA，2 mM EGTA，1%Triton X-100，0.1%SDS，50 mMβ-甘油磷酸鈉，2 mM原釩酸鈉，12.5 mM焦磷酸鈉，蛋白酶和磷酸酶抑制劑混合物）中裂解30分鐘，刮除，收集，離心澄清，并在LDS/還原試劑中制備蛋白質(zhì)印跡。樣品在4-12%的Bis-Tris凝膠上分離，轉(zhuǎn)移到PVDF上，并使用來自Cell Signaling的抗體檢測總和磷酸化-Smad2。凝膠使用奧德賽印跡掃描儀成像，并使用Licor軟件定量。測定磷酸：總Smad2比值，IC50定義為使磷酸：總比值降低50%的化合物濃度。

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代謝物鑒定。[3]
犬肝微粒體代謝物鑒定研究：犬肝微粒體購自Xenotech。將1.5 mL Eppendorf管中含有50 mM磷酸鉀緩沖液、肝微粒體部分（1.0 mg/mL蛋白質(zhì)）和10μM研究化合物的孵育混合物（800μL）預(yù)熱至37°C。輔因子在37°C下預(yù)孵育5分鐘。在0分鐘的時間點，取出孵育混合物（200μL）和輔因子溶液（50μL）的等分試樣，并用終止溶液[250μL，（80/20/1，乙腈/乙醇/乙酸，v/v/v）]粉碎。通過加入150μL NADPH生成系統(tǒng)[2.2 mM NADP、28 mM葡萄糖-6-磷酸和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（6單位/mL）以及4.0 mM UDPGA的2%碳酸氫鈉溶液]開始反應(yīng)，并在37°C下孵育樣品（最終體積750μL）。沒有使用含有適量甲醇的空白培養(yǎng)基代替肝微粒體化合物進(jìn)行藥物對照培養(yǎng)。孵育30分鐘后，通過加入一體積的終止溶液終止反應(yīng)。樣品以34000rpm離心5分鐘，將50μL上清液注入LC/MS進(jìn)行代謝物鑒定。犬肝細(xì)胞代謝產(chǎn)物鑒定研究：犬肝細(xì)胞（Db157）購自CellzDirect。將由William培養(yǎng)基E（pH=7.4）、肝細(xì)胞懸浮液（70萬個細(xì)胞/mL）和10μM研究化合物組成的總體積為600μL的孵育混合物放入12孔培養(yǎng)板的單孔中，在37°C下孵育4小時。使用含有適量甲醇的空白培養(yǎng)基代替對肝細(xì)胞的積極治療，沒有同時進(jìn)行藥物對照培養(yǎng)。孵育后，從每個孔的底部刮下細(xì)胞，并與600μL的終止溶液混合。然后將混合物儲存在-80°C的冰箱中。樣品以34000rpm離心5分鐘，將50μL上清液注入LC/MS進(jìn)行代謝物鑒定。

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結(jié)合模式：[3]
GSK2118436/Dabrafenib是B-Raf11的ATP競爭性抑制劑，根據(jù)GSK2118436與最近報道的B-RafV600E晶體結(jié)構(gòu)對接的模型，推測其與激酶的非活性樣構(gòu)象結(jié)合（圖S1），該晶體結(jié)構(gòu)與其他小分子ATP結(jié)合位點抑制劑結(jié)合。1在該模型中，αC螺旋相對于活性樣構(gòu)象“移位”，保守的賴氨酸和谷氨酸之間的鹽橋被打破。雖然Phe595不處于“DFG out”構(gòu)象，但它會旋轉(zhuǎn)形成類似于拉帕替尼/EGFR共結(jié)構(gòu)中觀察到的口袋底部。2嘧啶N1與酶ATP結(jié)合口袋中的Cys532形成經(jīng)典的鉸鏈相互作用。叔丁基和噻唑核在P-環(huán)下方結(jié)合，只留下相對較小的一部分抑制劑作為溶劑暴露。預(yù)計GSK2118436的芳基磺酰胺頭基會結(jié)合到親脂性后囊中，使磺酰胺與Asp594和Phe595的骨架NH形成兩個氫鍵?；酋０種H以脫質(zhì)子化形式描述，留下氮作為氫鍵受體參與。在R2處帶有氟取代的化合物中觀察到的效力的顯著提高被認(rèn)為是調(diào)節(jié)磺酰胺NH的pKa的結(jié)果，這可以在細(xì)胞pH值下增加12的電離，并為頭基結(jié)合提供更有利的構(gòu)象。相反，在R1處含有氟取代的化合物（化合物4和9）可能會誘導(dǎo)結(jié)合袋中苯磺酰胺部分的不利構(gòu)象，這可能是用這些類似物觀察到的靶親和力降低的原因。含苯胺尾部分子的類似模型（如1）表明，尾部基團(tuán)中的芳香環(huán)主要位于B-Raf結(jié)合口袋內(nèi)，而嗎啉代環(huán)延伸到溶劑暴露區(qū)域。比較1和2，在將尾部完全截斷為“裸”氨基嘧啶并損失13個重原子后，觀察到效力下降了10倍。盡管效力略有下降，但與1相比，2實際上表現(xiàn)出更高的配體效率（2的LE=0.30比1的LE=0.25），因為2中所有剩余的重原子都完全包含在結(jié)合袋中。

對于長期增殖測定，將細(xì)胞置于含有 10% FBS 的 RMPI-1640 中 12 天，并用單一化合物或化合物組合進(jìn)行處理。該測定涉及至少一種化合物治療替代。 12 天后，使用 50% 乙醇中的 0.5% 亞甲藍(lán)對細(xì)胞進(jìn)行染色。使用平板掃描儀拍攝照片。

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A375PF11細(xì)胞（以下簡稱A375）暴露于濃度逐漸增加的Dabrafenib和GSK2118436中，并保持在1.2或1.6μmol/L的終濃度。同樣，YUSIT1細(xì)胞暴露于0.1μmol/L的GSK2118443中。通過限制稀釋從這些群體中分離出單細(xì)胞克隆。通過SNP芯片分析確定，A375克隆與親本A375細(xì)胞有95%的相似性。通過外顯子組測序確定，具有代表性的抗性YUSIT1克隆共享100%的親本YUSIT1 SNP。在實驗之前，所有細(xì)胞在含有10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基中生長至少一代，不含GSK2118436。[2]

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Affymetrix表達(dá)分析： 選擇16R6-4與A375進(jìn)行比較，分別用Dabrafenib/GSK2118436和GSK1120212單獨和聯(lián)合處理24小時。數(shù)據(jù)分析按照補(bǔ)充方法中的描述進(jìn)行。微陣列數(shù)據(jù)保存在NCBI的基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫（GEO，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)可通過GEO系列登錄號GSE35230訪問。[2]

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細(xì)胞生長抑制和凋亡測定： 如前所述，使用CellTiter Glo 用化合物或化合物組合處理3天后，估計細(xì)胞生長的抑制作用。在用化合物進(jìn)行類似處理24小時后，通過Caspase-Glo 3/7測定法 測定Caspase-3/7活性。在3天生長試驗之前，用補(bǔ)充方法中所述的短干擾RNA（siRNA）、短發(fā)夾RNA（shRNA）或表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞。 對于長期增殖試驗，細(xì)胞被鋪板并用含有10%FBS的RMPI-1640中的化合物或化合物組合處理12天。在試驗過程中，至少更換了一次化合物處理。12天后，用50%乙醇中的0.5%亞甲基藍(lán)對細(xì)胞進(jìn)行染色。使用平板掃描儀拍攝圖像[2]。

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如前所述，從2至4天的Sprague-Dawley大鼠制備和培養(yǎng)新生大鼠心肌細(xì)胞。人心臟成纖維細(xì)胞在成纖維細(xì)胞生長培養(yǎng)基-3中生長。在實驗前一天接種成纖維細(xì)胞（密度為24小時后達(dá)到90%融合），并在含有0.1%（v/v）胎牛血清和100U/ml青霉素和鏈霉素的M199培養(yǎng)基中同步過夜。細(xì)胞暴露于 Dabrafenib中，并在收獲用于免疫印跡的時間內(nèi)暴露[4]。

本研究選用26只10周齡、定時交配、無病毒抗體的SD（Crl:CD[SD]）雌性大鼠作為試驗系統(tǒng)，這些雌性大鼠產(chǎn)下幼鼠。從產(chǎn)后第20天到第23天，對交配雌鼠進(jìn)行監(jiān)測，觀察其是否自然分娩（分娩完成當(dāng)天記為PND 0）。分娩完成后，分別在PND 3和6對幼鼠進(jìn)行檢查，包括外部形態(tài)學(xué)檢查、性別鑒定和個體體重測量。根據(jù)臨床癥狀和體重選擇合適的產(chǎn)仔母鼠及其幼鼠進(jìn)行研究，然后根據(jù)臨床觀察結(jié)果和PND 3時各窩幼鼠的平均體重，將選定的母鼠及其幼鼠隨機(jī)分配到不同的研究組。在PND 3或4時，將每窩幼鼠的數(shù)量減少到4或5只雄性和雌性，僅需少量代養(yǎng)即可達(dá)到所需的性別比例。這有助于盡可能地保持自然產(chǎn)仔數(shù)。記錄由原母鼠和代養(yǎng)母鼠撫養(yǎng)的幼崽信息。每只幼崽都用爪子紋身進(jìn)行識別。非同窩幼崽盡可能地被分組飼養(yǎng)。根據(jù)每日體重，以5 ml/kg的劑量，通過灌胃法將達(dá)拉非尼比（Dabrafenibis）懸浮于純凈水中，配制成賦形劑、0.5%羥丙基甲基纖維素K15M和0.1% (v/v) Tween80的懸浮液，灌胃給予年輕的雄性和雌性大鼠。

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A375P F11黑色素瘤異種移植研究。[3]
將細(xì)胞植入裸鼠體內(nèi)，并培養(yǎng)成腫瘤異種移植瘤。當(dāng)腫瘤體積達(dá)到約150-200mm3時開始給藥。 達(dá)拉非尼/GSK2118436 采用灌胃法給藥，劑量為 0.2 mL/20 克體重，溶于含 0.5% 羥丙基甲基纖維素和 0.2% Tween-80 的蒸餾水中，pH 值為 8.0。每日給藥，持續(xù)規(guī)定療程。結(jié)果以每組 7-8 只小鼠的平均腫瘤體積表示。每周使用游標(biāo)卡尺測量兩次腫瘤大小，并使用長橢球方程（腫瘤體積 mm3 = (長度 x 寬度2) x 0.5）根據(jù)二維測量值估算腫瘤體積。完全腫瘤消退定義為單個腫瘤體積減少 >93%，且持續(xù)至少 1 周。

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藥代動力學(xué) (PK) 分析。[3]
抽取血液后立即用等體積的水進(jìn)行溶血。將腫瘤組織用聚四氟乙烯勻漿器勻漿，每體積冷凍組織加入4倍體積的水，測定腫瘤中化合物的濃度。取等分勻漿后的腫瘤組織和血液樣本進(jìn)行速凍，隨后采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC/MS/MS）分析化合物濃度。

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組織中pERK水平的藥效學(xué)測定。[3]
收集組織，用Medimachine勻漿器和1 mL裂解緩沖液（25 mM Tris-HCl (pH 7.5)、2 mM EDTA (pH 8.0)、2 mM EGTA (pH 8.0)、1% Triton X-100、0.1% SDS、50 mM甘油磷酸鈉、2 mM Na3VO4、4 mM焦磷酸鈉、2倍磷酸酶抑制劑混合物）勻漿，并置于冰上。所有樣品均質(zhì)化后，勻漿液在4°C下以14,000 rpm離心15分鐘，并速凍以備后續(xù)分析。所有樣品均使用雙重ELISA法進(jìn)行分析，檢測總ERK1/2和磷酸化ERK1/2，操作步驟按照制造商說明進(jìn)行。使用MSD SI6000讀取結(jié)果。

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體內(nèi)小鼠研究[4]
野生型雄性（7周齡）C57Bl/6J小鼠在實驗前適應(yīng)環(huán)境2周。小鼠隨機(jī)分配至各處理組；體重數(shù)據(jù)見補(bǔ)充表S1。藥物輸送采用Alzet滲透泵（型號1007D或1004），并按照制造商說明進(jìn)行填充。小鼠通過微型泵分別輸注0.8 mg/kg/d血管緊張素II（AngII）或載體（酸化PBS），其中AngII不添加DMSO/PEG混合物[50% (v/v)二甲基亞砜（DMSO），20% (v/v)聚乙二醇400，5% (v/v)丙二醇，0.5% (v/v)吐溫80]，而達(dá)拉非尼則以3 mg/kg/d的劑量溶于DMSO/PEG混合物中。AngII和達(dá)拉非尼分別使用不同的微型泵進(jìn)行輸注。微型泵在無菌PBS緩沖液（37°C）中孵育過夜，然后在異氟烷（誘導(dǎo)濃度5%，維持濃度2-2.5%）與2升/分鐘氧氣混合的持續(xù)吸入麻醉下皮下植入，如前所述。

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心肌細(xì)胞大小和纖維化的組織學(xué)評估[4]
組織學(xué)染色和分析按先前所述進(jìn)行，采用蘇木精-伊紅（H&E）染色評估一般形態(tài)，采用馬松三色染色和苦味酸-天狼星紅（PSR）染色評估纖維化。用于研究達(dá)拉非尼對血管緊張素II（AngII）誘導(dǎo)的心臟病理學(xué)影響的切片由HistologiX Limited公司制備和染色，研究時間為28天。由對治療組不知情的獨立評估人員進(jìn)行分析。

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成年大鼠心臟灌注[4]
使用成年雄性（300-350 g）Sprague-Dawley大鼠進(jìn)行心臟灌注。按照所述方法制備心臟，并以Langendorff模式進(jìn)行灌注。心臟用Krebs-Henseleit碳酸氫鹽緩沖鹽水（25 mM NaHCO3、119 mM NaCl、4.7 mM KCl、2.5 mM CaCl2、1.2 mM MgSO4、1.2 mM KH2PO4，pH 7.4，含10 mM葡萄糖，并用95% O2/5% CO2平衡）灌注15分鐘，灌注液中分別添加或不添加達(dá)拉非尼（5 μM）或曲美替尼（1 μM）。達(dá)拉非尼和曲美替尼購自Selleck Chemicals公司。灌注持續(xù)10分鐘，分別在不添加或添加人FGF2（0.5 μg/ml；英國Cell Guidance Systems Ltd.公司）的情況下進(jìn)行。將心臟置于液氮冷卻的鋁鉗之間進(jìn)行“冷凍鉗夾”，并在液氮下研磨成粉末。心臟粉末儲存于-80°C。

吸收、分布和排泄
口服給藥后，達(dá)拉非尼達(dá)到血漿峰濃度（Tmax）的中位時間為 2 小時。口服達(dá)拉非尼的平均絕對生物利用度為 95%。單次給藥后，達(dá)拉非尼的暴露量（Cmax 和 AUC）在 12 mg 至 300 mg 的劑量范圍內(nèi)呈劑量比例增加，但每日兩次重復(fù)給藥后，其增加幅度小于劑量比例。每日兩次重復(fù)給藥150 mg后，平均累積率為0.73，穩(wěn)態(tài)AUC的受試者間變異系數(shù)(CV%)為38%。
糞便排泄是主要的消除途徑，占放射性劑量的71%，而尿液排泄僅占總放射性的23%（以代謝物形式）。
表觀分布容積(Vc/F)為70.3 L。由于達(dá)拉非尼是底物，并通過P-糖蛋白和乳腺癌耐藥蛋白進(jìn)行外排，因此其腦分布受限。
單次給藥后達(dá)拉非尼的清除率為17.0 L/h，每日兩次給藥2周后為34.4 L/h。

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代謝/代謝物
達(dá)拉非尼的代謝主要由CYP2C8介導(dǎo)。達(dá)拉非尼經(jīng)CYP3A4代謝生成羥基達(dá)拉非尼。羥基達(dá)拉非尼進(jìn)一步經(jīng)CYP3A4氧化生成羧基達(dá)拉非尼，隨后經(jīng)膽汁和尿液排出。羧基達(dá)拉非尼脫羧生成去甲基達(dá)拉非尼；去甲基達(dá)拉非尼可能被腸道重吸收。去甲基達(dá)拉非尼進(jìn)一步經(jīng)CYP3A4代謝生成氧化代謝物。

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生物半衰期
口服達(dá)拉非尼的平均終末半衰期為8小時。羥基達(dá)拉非尼的終末半衰期（10小時）與達(dá)拉非尼相似，而羧基達(dá)拉非尼和去甲基達(dá)拉非尼代謝物的半衰期更長（21至22小時）。

肝毒性
接受達(dá)拉非尼單藥治療的患者中，11%出現(xiàn)血清ALT水平升高，但所有升高均超過正常值上限的5倍。達(dá)拉非尼聯(lián)合曲美替尼治療時，35%至42%的患者出現(xiàn)血清ALT升高，其中4%的患者ALT水平超過正常值上限的5倍。同樣，接受達(dá)拉非尼單藥治療的患者中，26%出現(xiàn)血清堿性磷酸酶升高，而接受達(dá)拉非尼聯(lián)合曲美替尼治療的患者中，60%至67%出現(xiàn)血清堿性磷酸酶升高。這些異常大多無癥狀且完全可逆。在達(dá)拉非尼上市前研究中，未報告任何臨床上明顯的急性肝損傷或肝功能衰竭病例；自其獲批上市并廣泛應(yīng)用以來，也未見已發(fā)表的達(dá)拉非尼肝毒性報告。
可能性評分：E（未經(jīng)證實但懷疑是臨床上明顯的肝損傷的原因）。

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妊娠和哺乳期影響
? 哺乳期用藥概述
目前尚無關(guān)于達(dá)拉非尼在哺乳期臨床應(yīng)用的信息。由于達(dá)拉非尼與血漿蛋白的結(jié)合率超過99%，因此其在乳汁中的含量可能很低。制造商建議在達(dá)拉非尼治療期間以及末次給藥后 2 周內(nèi)停止母乳喂養(yǎng)。
? 對母乳喂養(yǎng)嬰兒的影響
截至修訂日期，未找到相關(guān)的已發(fā)表信息。
? 對泌乳和母乳的影響
截至修訂日期，未找到相關(guān)的已發(fā)表信息。

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蛋白結(jié)合
達(dá)拉非尼與人血漿蛋白的結(jié)合率為 99.7%。

[1]. 2009, EORTC International Conference. Abst B88.

[2]. Mol Cancer Ther. 2012 Apr;11(4):909-20.

[3]. ACS Med Chem Lett. 2013 Feb 7;4(3):358-62.

[4]. Clin Sci (Lond). 2021 Jul 30;135(14):1631-1647.

藥效學(xué)
達(dá)拉非尼是一種激酶抑制劑，主要用于靶向多種癌癥中的BRAF V600E突變。盡管達(dá)拉非尼和曲美替尼均抑制RAS/RAF/MEK/ERK通路，但它們抑制的是該通路的不同效應(yīng)分子，因此可以提高緩解率并降低耐藥性，且不會產(chǎn)生累積毒性。曲美替尼獲批用于治療黑色素瘤是基于COMBI-AD研究的結(jié)果。COMBI-AD是一項III期臨床研究，納入了870例接受完整手術(shù)切除的III期BRAF V600E/K突變陽性黑色素瘤患者，并給予達(dá)拉非尼聯(lián)合曲美替尼治療?；颊呓邮苓_(dá)拉非尼（150 mg，每日兩次）+曲美替尼（2 mg，每日一次）聯(lián)合治療（n = 438）或匹配的安慰劑（n = 432）。經(jīng)過2.8年的中位隨訪，主要終點——無復(fù)發(fā)生存期（RFS）已達(dá)到。在甲狀腺癌方面，達(dá)拉非尼聯(lián)合曲美替尼是首個被證實對BRAF V600E突變型間變性甲狀腺癌具有強(qiáng)效臨床活性且耐受性良好的方案。這些發(fā)現(xiàn)代表了該罕見病治療領(lǐng)域的重要進(jìn)展。

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達(dá)拉非尼是一種有機(jī)氟化合物和抗腫瘤藥物，其甲磺酸鹽用于治療轉(zhuǎn)移性黑色素瘤。它具有抗腫瘤、B-Raf抑制劑和抗冠狀病毒藥物的雙重作用。它是一種磺酰胺類、有機(jī)氟化合物、1,3-噻唑類化合物和氨基嘧啶類化合物。
甲磺酸達(dá)拉非尼（Tafinlar）是一種可逆的ATP競爭性激酶抑制劑，靶向MAPK通路。該藥于2013年5月29日獲批用于治療攜帶V600E或V6000K突變的黑色素瘤。它也曾用于治療攜帶相同突變的轉(zhuǎn)移性非小細(xì)胞肺癌。2018年5月，達(dá)拉非尼（Tafinlar）與美金剛（Mekinist，[DB08911]）聯(lián)合用藥獲批用于治療由BRAF V600E基因異常引起的間變性甲狀腺癌。
達(dá)拉非尼是一種激酶抑制劑。達(dá)拉非尼的作用機(jī)制是作為蛋白激酶抑制劑、細(xì)胞色素P450 3A4誘導(dǎo)劑、細(xì)胞色素P450 2B6誘導(dǎo)劑、細(xì)胞色素P450 2C8誘導(dǎo)劑、細(xì)胞色素P450 2C9誘導(dǎo)劑、細(xì)胞色素P450 2C19誘導(dǎo)劑、有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運多肽1B1抑制劑、有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運多肽1B3抑制劑、有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運蛋白1抑制劑、有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運蛋白3抑制劑以及乳腺癌耐藥蛋白抑制劑。
達(dá)拉非尼是BRAF激酶突變體的選擇性抑制劑，可單獨使用或與曲美替尼聯(lián)合用于治療晚期惡性黑色素瘤。達(dá)拉非尼治療期間會出現(xiàn)短暫的血清轉(zhuǎn)氨酶升高，但尚未發(fā)現(xiàn)與臨床上明顯的急性肝損傷病例相關(guān)。
達(dá)拉非尼是一種口服生物利用度高的B-raf (BRAF)蛋白抑制劑，具有潛在的抗腫瘤活性。達(dá)拉非尼選擇性地結(jié)合并抑制B-raf的活性，從而可能抑制含有突變BRAF基因的腫瘤細(xì)胞的增殖。 B-Raf屬于Raf/Mil家族的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在調(diào)節(jié)MAP激酶/ERK信號通路中發(fā)揮作用，該通路可能因BRAF基因突變而持續(xù)激活。
達(dá)布拉非尼是一種小分子藥物，其臨床試驗階段最高為IV期（涵蓋所有適應(yīng)癥），于2013年首次獲批，目前有7項已獲批適應(yīng)癥和19項在研適應(yīng)癥。

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Ras-Raf-MEK-ERK通路的激活與多種人類癌癥相關(guān)。生長因子受體受細(xì)胞外配體刺激后激活Ras，進(jìn)而啟動通過Raf、MEK和ERK絲氨酸/蘇氨酸激酶的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)反應(yīng)。B-Raf激酶的突變可持續(xù)激活MAPK信號通路，從而繞過上游刺激。該基因與多種人類癌癥相關(guān)，尤其是B-RafV600E突變體的出現(xiàn)及其在黑色素瘤、結(jié)直腸癌、卵巢癌、乳頭狀甲狀腺癌和膽管癌中的高發(fā)率。選擇性且高效抑制B-Raf有望為攜帶突變型B-Raf腫瘤的患者提供潛在療法，因為這類腫瘤對該通路存在依賴性。我們發(fā)現(xiàn)了一種新型高效且選擇性的Raf激酶抑制劑，能夠抑制野生型B-Raf、B-RafV600E和c-Raf的激酶活性，其IC50值分別為3.2 nM、0.8 nM和5.0 nM。對超過270種激酶的激酶譜篩選表明，該抑制劑對Raf激酶具有選擇性，對B-Raf的選擇性比91%的其他受試激酶高約400倍。該抑制劑通過特異性抑制細(xì)胞內(nèi)的B-RafV600E激酶，導(dǎo)致ERK磷酸化水平降低，并通過首先阻滯于細(xì)胞周期的G1期來抑制細(xì)胞增殖，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。這種抑制作用對特異性編碼B-RafV600E突變的癌細(xì)胞具有選擇性?？诜摶衔锟梢种圃诿庖呷毕菪∈笃は乱浦驳腂-RafV600E突變型黑色素瘤（A375P）和結(jié)腸癌（Colo205）人腫瘤異種移植瘤的生長。目前，這種細(xì)胞特異性B-RafV600E抑制劑正在進(jìn)行I期人體臨床試驗。引用信息：Mol Cancer Ther 2009;8(12 Suppl):B88.[1]

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在包括黑色素瘤在內(nèi)的多種人類腫瘤中，已觀察到由組成型活性B-RafV600E突變酶引起的MAP激酶通路過度激活。本文報道了達(dá)拉非尼/GSK2118436的發(fā)現(xiàn)和生物學(xué)評價。達(dá)拉非尼是一種選擇性Raf激酶抑制劑，在體外對致癌性B-Raf驅(qū)動的黑色素瘤和結(jié)直腸癌細(xì)胞具有強(qiáng)效活性，并在B-RafV600E人黑色素瘤小鼠模型中表現(xiàn)出顯著的體內(nèi)抗腫瘤和藥效學(xué)活性。GSK2118436被確定為候選藥物，早期臨床結(jié)果顯示其對B-Raf突變型黑色素瘤患者具有顯著療效。 [3]

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總之，先導(dǎo)化合物 1 在高等動物中具有高活性但藥代動力學(xué)性質(zhì)較差，因此被迅速改進(jìn)為臨床開發(fā)候選藥物 達(dá)拉非尼/GSK2118436 (12)。通過詳細(xì)且迭代的構(gòu)效關(guān)系 (SAR) 研究，我們鑒定了 B-RafV600E 活性的關(guān)鍵貢獻(xiàn)因素（磺酰胺頭部、R2 氟化和叔丁基噻唑核心），從而去除先導(dǎo)化合物結(jié)構(gòu)中非必需的部分，并實現(xiàn)了對整個激酶組的高選擇性。由于最初的先導(dǎo)化合物具有較高的酶活性和細(xì)胞活性，我們通過對模板進(jìn)行多項改造來解決藥代動力學(xué)問題，最終獲得了化合物 12 所觀察到的改善的多物種藥代動力學(xué)性質(zhì)。GSK2118436 在嚙齒動物中實現(xiàn)了高暴露量，我們能夠在兩種體內(nèi)模型中證明其靶點相關(guān)的藥理學(xué)特性，從而對該分子進(jìn)入臨床研究階段充滿信心。此外，高階物種藥代動力學(xué)的顯著改善使得藥物暴露量得以達(dá)到，從而能夠充分探索該分子在臨床前階段的安全性。最后，與化合物 1 相比，分子量降低了 20% 以上，從而改善了其理化性質(zhì)，加速了鹽型（甲磺酸鹽）及其適用于早期臨床研究的形式的鑒定。
本文所述的努力最終促成了 GSK2118436（達(dá)拉非尼）的發(fā)現(xiàn)，該藥物目前正在 B-Raf 突變腫瘤中進(jìn)行后期臨床研究。GSK2118436 在攜帶激活型 B-Raf 突變的黑色素瘤患者（包括腦轉(zhuǎn)移患者）中顯示出顯著療效，并且與 MEK 抑制劑曲美替尼聯(lián)合用藥時，進(jìn)一步增強(qiáng)了其臨床活性。這些研究的詳細(xì)內(nèi)容將在適當(dāng)時候公布。[3]

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我們工作的最后考慮因素是使用達(dá)拉非尼等藥物治療心臟疾病的潛在影響。達(dá)拉非尼本身似乎不具有心臟毒性，且通常耐受性良好。癌癥患者服用達(dá)拉非尼會出現(xiàn)一些副作用，通?？赏ㄟ^降低劑量來控制。最嚴(yán)重的副作用可能是皮膚鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生率增加（約占12%）。因此，如果將達(dá)拉非尼用于治療高血壓性心臟病，則可能需要考慮劑量監(jiān)測以及患者是否存在其他疾病（例如癌癥）的易感性（或許可以從“腫瘤心臟病學(xué)”的角度來考慮）。盡管如此，使用達(dá)拉非尼等藥物來減少心肌纖維化可能是一種治療心臟疾病的有效手段，其益處可能大于這些風(fēng)險。[4]

C23H20F3N5O2S2

519.56

519.101

C, 53.17; H, 3.88; F, 10.97; N, 13.48; O, 6.16; S, 12.34

1195765-45-7

Dabrafenib Mesylate;1195768-06-9;Dabrafenib-d9;1423119-98-5

44462760

White to off-white solid powder

1.4±0.1 g/cm3

653.7±65.0 °C at 760 mmHg

349.2±34.3 °C

0.0±2.0 mmHg at 25°C

1.626

3.54

148.21

2

11

6

35

817

0

S1C(C2C([H])=C([H])N=C(N([H])[H])N=2)=C(C2C([H])=C([H])C([H])=C(C=2F)N([H])S(C2C(=C([H])C([H])=C([H])C=2F)F)(=O)=O)N=C1C(C([H])([H])[H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H]

BFSMGDJOXZAERB-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C23H20F3N5O2S2/c1-23(2,3)21-30-18(19(34-21)16-10-11-28-22(27)29-16)12-6-4-9-15(17(12)26)31-35(32,33)20-13(24)7-5-8-14(20)25/h4-11,31H,1-3H3,(H2,27,28,29)

N-[3-[5-(2-aminopyrimidin-4-yl)-2-tert-butyl-1,3-thiazol-4-yl]-2-fluorophenyl]-2,6-difluorobenzenesulfonamide

GSK2118436A; GSK-2118436B; GSK 2118436A; Dabrafenib; 1195765-45-7; GSK2118436-A; UNII-QGP4HA4G1B; QGP4HA4G1B; GSK-2118436-A; CHEBI:75045; Benzenesulfonamide, N-[3-[5-(2-amino-4-pyrimidinyl)-2-(1,1-dimethylethyl)-4-thiazolyl]-2-fluorophenyl]-2,6-difluoro-; GSK2118436B (Dabrafenib Mesylate ); GSK-2118436A; GSK 2118436B. Trade name: Tafinlar

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: 5 mg/mL (9.62 mM) in 30% PEG400 0.5% Tween80 + 5% Propanediol 64.5%H2O (這些助溶劑從左到右依次添加，逐一添加), 懸浮液；超聲助溶。

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配方 2 中的溶解度: 2.5 mg/mL (4.81 mM) in 0.5%HPMC (這些助溶劑從左到右依次添加，逐一添加), 懸濁液; 超聲助溶。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (4.81 mM) (飽和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (這些助溶劑從左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制備1 mL的工作液，可將 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO儲備液加入到400 μL PEG300中，混勻；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混勻；加入450 μL生理鹽水定容至1 mL。
*20% SBE-β-CD 生理鹽水溶液的制備（4°C，1 周）：將 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理鹽水中，得到澄清溶液。

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配方 4 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (4.81 mM) (飽和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (這些助溶劑從左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制備1 mL的工作液，可將100μL 25.0mg/mL澄清的DMSO儲備液加入到900μL 20％SBE-β-CD生理鹽水中，混勻。
*20% SBE-β-CD 生理鹽水溶液的制備（4°C，1 周）：將 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理鹽水中，得到澄清溶液。

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配方 5 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (4.81 mM) (飽和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (這些助溶劑從左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制備1 mL的工作液，可將100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 儲備液加入到 900 μL 玉米油中并混合均勻。

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配方 6 中的溶解度: 2.5 mg/mL (4.81 mM) in 5% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 50% Saline (這些助溶劑從左到右依次添加，逐一添加), 懸濁液; 超聲助溶。
*生理鹽水的制備：將 0.9 g 氯化鈉溶解在 100 mL ddH?O中，得到澄清溶液。

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配方 7 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (4.81 mM)(飽和度未知) in 5% DMSO + 95% (20% SBE-β-CD in Saline) (這些助溶劑從左到右依次添加，逐一添加),澄清溶液。
*20% SBE-β-CD 生理鹽水溶液的制備（4°C，1 周）：將 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理鹽水中，得到澄清溶液。

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請根據(jù)您的實驗動物和給藥方式選擇適當(dāng)?shù)娜芙馀浞?方案：
1、請先配制澄清的儲備液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(儲備液));
2、取適量母液，按從左到右的順序依次添加助溶劑，澄清后再加入下一助溶劑。以 下列配方為例說明 (注意此配方只用于說明，并不一定代表此產(chǎn)品 的實際溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假設(shè)最終工作液的體積為 1 mL, 濃度為5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 儲備液加到 400 μL PEG300 中，混合均勻/澄清；向上述體系中加入50 μL Tween-80，混合均勻/澄清；然后繼續(xù)加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶劑前顯示的百分比是指該溶劑在最終溶液/工作液中的體積所占比例;
4、 如產(chǎn)品在配制過程中出現(xiàn)沉淀/析出，可通過加熱(≤50℃)或超聲的方式助溶;
5、為保證最佳實驗結(jié)果，工作液請現(xiàn)配現(xiàn)用！
6、如不確定怎么將母液配置成體內(nèi)動物實驗的工作液，請查看說明書或聯(lián)系我們;
7、 以上所有助溶劑都可在 Invivochem.cn網(wǎng)站購買。