背景[1-3]
LS174T細(xì)胞是LS 180結(jié)腸腺癌細(xì)胞株的胰蛋白酶化變種。它比親本更易傳代，像LS 180一樣生成大量的癌胚抗原(CEA)。電鏡研究表明，它有豐富的微絲和胞漿黏液素液泡；血清學(xué)檢測(cè)直腸抗原3陽(yáng)性；p53抗原表達(dá)陰性，但mRNA表達(dá)陽(yáng)性；角蛋白陽(yáng)性；癌基因c-myc、N-myc、H-ras、N-ras、Myb和fos的表達(dá)呈陽(yáng)性；癌基因k-ras和sis的表達(dá)未做檢測(cè)；可產(chǎn)生IL-10、IL-6和黏蛋白。
細(xì)胞培養(yǎng)方法：
1、細(xì)胞傳代：細(xì)胞密度達(dá)到80-90%時(shí)即可傳代
①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次；
②加入2ml0.25%胰酶（T25瓶），使胰酶覆蓋整個(gè)瓶或皿，蓋好放入培養(yǎng)箱消化；
③1-2min后，顯微鏡下觀察細(xì)胞，若大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入完全培養(yǎng)基終止消化；若細(xì)胞還是貼壁，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止；
④將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清；
⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基；
⑥懸浮細(xì)胞直接離心收集，細(xì)胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中。
2、細(xì)胞復(fù)蘇：
①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時(shí)間1min左右，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻。
②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻，將細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)加適量培養(yǎng)基。
3、細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)進(jìn)行細(xì)胞凍存保種
①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次，加入1mL 0.25%胰蛋白酶（T25瓶）
②1-2min后，顯微鏡下觀察細(xì)胞，大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入完全培養(yǎng)基終止消化；
③將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清，加1ml凍存液重懸細(xì)胞；
④將凍存管放入程序降溫盒，放入-80℃冰箱，4小時(shí)后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮罐儲(chǔ)存。
應(yīng)用[4][5]
用于HDAC抑制劑對(duì)LS174T細(xì)胞組蛋白乙酰化及ASC基因表達(dá)的作用研究
研究去乙?；敢种苿┒∷徕c(sodium butyrate,NaBu)對(duì)人結(jié)腸癌LS174T細(xì)胞中的組蛋白H3乙?；揭约皩?duì)抑癌基因ASC表達(dá)的影響,從而探討丁酸鈉在細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)和結(jié)腸癌治療中的可行性。
方法:劑量組使用1、5、10 mmol/L濃度的NaBu分別作用LS174T細(xì)胞24小時(shí),時(shí)間組使用5 mmol/L NaBu作用LS174T細(xì)胞12、24、48、72小時(shí)。提取細(xì)胞的mRNA和總蛋白,采用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)ASC基因表達(dá)情況,同時(shí)使用免疫印跡技術(shù)(Western blot)檢測(cè)組蛋白H3的乙酰化水平及ASC蛋白的表達(dá)情況。
MTT用于檢測(cè)細(xì)胞增殖率,并使用DAPI染色和AnnexinV-FITC方法測(cè)定細(xì)胞凋亡情況。
結(jié)果:隨著NaBu作用濃度的增加組蛋白H3乙?；潭炔粩嘣黾?使用相同濃度NaBu作用細(xì)胞不同時(shí)間時(shí),結(jié)果顯示藥物作用時(shí)間與組蛋白的乙?；潭瘸收嚓P(guān)。
ASC基因和蛋白的表達(dá)也同樣受其影響,并且ASC表達(dá)的恢復(fù)和上調(diào)引起LS174T細(xì)胞增殖率下降和凋亡增加。
結(jié)論:NaBu對(duì)組蛋白H3乙?；恼{(diào)節(jié)具有時(shí)間和劑量依賴性,NaBu能夠上調(diào)LS174T細(xì)胞組蛋白H3的乙?；?降低細(xì)胞增殖率,促進(jìn)抑癌基因ASC的表達(dá)和細(xì)胞凋亡。
參考文獻(xiàn)
[1]HIC1(Hypermethylated in Cancer 1)epigenetic silencing in tumors[J].Capucine Fleuriel,Majid Touka,Gaylor Boulay,Cateline Guérardel,Brian R.Rood,Dominique Leprince.International Journal of Biochemistry and Cell Biology.2008(1)
[2]Histone deacetylase regulation of immune gene expression in tumor cells[J].A.Nazmul H.Khan,Thomas B.Tomasi.Immunologic Research.2008(2)
[3]Histone deacetylase inhibitor Trichostatin A induces global and gene-specific DNA demethylation in human cancer cell lines[J].Biochemical Pharmacology.2007(9)
[4]Apicidin,a novel histone deacetylase inhibitor,has profound anti-growthactivity in human endometrial and ovarian cancer cells[J].Tami Ueda,Noriyuki Takai,Masakazu Nishida,Kaei Nasu,Hisashi Narahara.International Journal of Molecular Medicine.2007(2)
[5]柏景喬.HDAC抑制劑對(duì)LS174T細(xì)胞組蛋白乙?；癆SC基因表達(dá)的作用[D].大連醫(yī)科大學(xué),2009.