背景[1-3]
CELL COUNTING KIT-8(CCK-8試劑盒)是一種基于WST-8（化學名：2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑單鈉鹽）的廣泛應(yīng)用于細胞增殖和細胞毒性的快速高靈敏度檢測試劑盒。
WST-8工作原理：在電子耦合試劑存在的情況下，可以被線粒體內(nèi)的脫氫酶還原生成高度水溶性的橙黃色的甲臜產(chǎn)物（formazan）。顏色的深淺與細胞的增殖成正比，與細胞毒性成反比。使用酶標儀在450 nm波長處測定OD值，間接反映活細胞數(shù)量。
WST-8是MTT的一種升級替代產(chǎn)品，和MTT或其它MTT類似產(chǎn)品如XTT、MTS等相比有明顯的優(yōu)點。首先，MTT被線粒體內(nèi)的一些脫氫酶還原生成的formazan不是水溶性的，需要有特定的溶解液來溶解；而WST-8和XTT、MTS產(chǎn)生的formazan都是水溶性的，可以省去后續(xù)的溶解步驟。其次，WST-8產(chǎn)生的formazan比XTT和MTS產(chǎn)生的formazan更易溶解。再次，WST-8比XTT和MTS更加穩(wěn)定，使實驗結(jié)果更加穩(wěn)定。另外，WST-8和MTT、XTT等相比線性范圍更寬，靈敏度更高。
CCK-8試劑盒可以用于細胞因子等誘導(dǎo)的細胞增殖檢測，也可以用于抗癌藥物等對細胞有毒試劑誘導(dǎo)的細胞毒性檢測，或一些藥物誘導(dǎo)的細胞生長抑制檢測。
試劑盒僅一管已經(jīng)配制好的含有WST-8的CCK-8溶液，無須再進行任何配制等操作。無須使用同位素，所有的檢測步驟僅在同一塊96孔板內(nèi)完成。不必洗滌細胞，不必收集細胞，也不必采用額外的步驟去溶解formazan?？梢杂糜诖笈繕悠返臋z測。酚紅和血清對本試劑盒的測定無明顯影響。
WST-8對細胞無明顯毒性。加入CCK-8溶液顯色后，可以在不同時間反復(fù)用酶標儀讀板，使檢測時間更加靈活，便于找到測定時間。
應(yīng)用[4][5]
用于體外抗腫瘤藥物篩選中CCK-8、MTT和SRB法的比較研究
比較CCK-8、MTT、SRB三種檢測細胞增殖方法的相關(guān)性、重復(fù)性、穩(wěn)定性和靈敏性，探討使用三種方法進行抗腫瘤藥物體外篩選的適應(yīng)性。方法將懸浮生長的人紅細胞白血病細胞K562和貼壁生長的人肝癌細胞HepG2調(diào)整成1×103～1×106／ml之間的十個細胞濃度種于96孔板，分別用CCK-8、MTT和SRB法檢測其光密度（OD）值，比較三種方法的相關(guān)性；
三種方法分別重復(fù)三次，比較其重復(fù)性；于九個不同時間點測定其OD值，比較其穩(wěn)定性；檢測四個待測樣品和兩個已知抗腫瘤藥對兩株細胞的增殖抑制率，比較其靈敏性。
結(jié)果三種方法測得兩株細胞的OD值與細胞密度的相關(guān)系數(shù)（r）大于0.888（P＜0.05）。三種方法重復(fù)三次測得的OD值之間的相關(guān)系數(shù)大于0.956（P＜0.05）。CCK-8法和MTT法測得的OD值隨時間的延長而增加：CCK-8法72h測得的OD值為0h的6～7倍（P＜0.05），MTT法72h測得的OD值為0h的1.5倍（P＜0.05）左右，而SRB法1～72h不同時間點測得的OD值與0h相比無顯著性差異（P＞0.05）。
六個受試物分別用MTT法和SRB法測得的K562和HepG2半數(shù)抑制濃度(IC50)無顯著性差異（P＞0.05），而用CCK-8法測得的IC50低于MTT法和SRB法測得的結(jié)果（P＜0.05），以順鉑為例，MTT法和SRB法測得的IC50值約是CCK-8法的2～4倍和6倍。結(jié)論CCK-8、MTT、SRB法測得的OD值與細胞數(shù)目之間有良好的相關(guān)性；三種方法均有良好的重復(fù)性；SRB法的穩(wěn)定性優(yōu)于MTT法和CCK-8法；三種方法均可用于體外抗腫瘤藥物篩選，貼壁細胞和懸浮細胞均適用，所得結(jié)果相似；CCK-8法較MTT法和SRB法更為靈敏和便捷，但實驗成本相應(yīng)增加，更適應(yīng)于微量樣品的大規(guī)模篩選。
參考文獻
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