背景及概述^[1]

萊克多巴胺(ractopamine，RAC)是人工合成的β-腎上腺受體激動劑，屬于“瘦肉精”的一種，可以同時提高動物的日增質(zhì)量，提高飼料利用率，提高動物的蛋白質(zhì)含量。目前只有美國、加拿大、巴西等24個美洲和亞太地區(qū)允許將萊克多巴胺用于食用性動物(主要用于豬和牛)的促生長和提高瘦肉率。萊克多巴胺屬于激素類添加劑，而激素類飼料添加劑用于動物后，具有激素殘留的問題，對動物機體產(chǎn)生副作用，同時也會影響消費者的健康。歐盟早已明確禁止在食用性動物中使用包括萊克多巴胺在內(nèi)的所有β-腎上腺素興奮劑類藥物(歐盟96/22/EC法令)，我國也已經(jīng)于2002年明確將其列入《禁止在飼料和動物飲用水中使用的藥物品種目錄》。中華人民共和國工業(yè)和信息化部、農(nóng)業(yè)部、商務(wù)部、衛(wèi)生部、國家工商行政管理總局、國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局聯(lián)合發(fā)布公告，自2011年12月5日起在我國境內(nèi)禁止生產(chǎn)和銷售萊克多巴胺。近年來，我國出入境口岸也屢次在進口動物性食品中檢出萊克多巴胺。根據(jù)國家質(zhì)檢總局公布的信息，截至2007年8月底，廣東檢驗檢疫局轄區(qū)各口岸已從10批美國豬產(chǎn)品和一批加拿大豬產(chǎn)品中檢出萊克多巴胺殘留；2008年遼寧大窯灣口岸進出境動物產(chǎn)品中有4批次97.473噸來自美國的凍豬產(chǎn)品被檢出萊克多巴胺；2011年12月由美國進口的近23.5噸凍豬鼻在廣東入境時被檢出了萊克多巴胺；這些產(chǎn)品均依法全部退運出境。因此，出入境口岸對進出口動物性食品中萊克多巴胺的檢測具有十分重要的意義。

制備^[2]

β-腎上腺激動素萊克多巴胺的合成方法，包括以下步驟：

(1)在500mL三口瓶中加入20g對羥基苯乙酮、50mL苯和100mL飽和碳酸鈉水溶液，加熱至50℃，緩慢滴加24mL苯甲酰氯，滴加完畢后于40～90℃升溫回流2h，同時蒸餾出苯；然后慢慢加熱水50mL，繼續(xù)加熱蒸餾至蒸汽溫度90℃，冷卻，有白色晶體析出，抽濾，濾餅用水洗滌至中性，烘干，得酯化物苯甲酸(4-乙酰苯基)酯35.12g。此步收率為99.5％。

(2)將上述酯化物30g、四氯化碳150mL加入500mL三口瓶中，加熱升溫至40℃，緩慢滴加液溴12mL，然后緩慢升溫回流2h，冷卻，得白色結(jié)晶體，抽濾，洗滌，烘干，得溴化物苯甲酸(4-溴乙酰苯基)酯36.24g。此步收率90.6％。

(3)在500mL高壓反應(yīng)釜中，加入覆盆子酮25g、催化劑雷尼鎳2g、溶劑無水乙醇250mL，密封后，用氫氣置換三次，通入氨氣，保持壓力0.2MPa，常溫下反應(yīng)3h，停止通氨氣，放出余氨；然后通入氫氣，保持氫氣壓力0.5MPa，反應(yīng)10h，過濾，濾液在蒸餾裝置中蒸餾出溶劑至干，趁熱加入乙酸乙酯于70℃回流1h，冷卻至室溫，抽濾洗滌，濾餅烘干，得到胺化物1-甲基-3-(4-羥基苯基)-丙胺23.64g。此步收率94％。

(4)于500mL三口瓶中，加入上述溴化物30g、胺化物15g，加入乙酸乙酯80mL和飽和碳酸鈉水溶液100mL，常溫下攪拌反應(yīng)3h，抽濾洗滌，得到固體縮合產(chǎn)物苯甲酸[1-甲基-3-(4-羥基苯基)-丙胺基]-乙酰苯酯，不用烘干，直接用于下步反應(yīng)。

(5)將上述固體縮合產(chǎn)物投入500mL三口瓶中，加入200mL含氯化氫20％的鹽酸-甲醇溶液，加熱至60℃保持48h，冷卻，結(jié)晶，抽濾洗滌，經(jīng)烘干，得固體水解產(chǎn)物1-(4-羥基苯基)-2-[1-甲基-3-(4-羥基苯基)-丙胺基]-乙酮22.03g。此步收率90％。

(6)把上述固體水解產(chǎn)物加入500mL反應(yīng)釜中，加入甲醇300mL、鈀碳2g，密封后，用氫氣置換三次，然后加氫至壓力0.45MPa，加熱至40℃，攪拌反應(yīng)20h，冷卻結(jié)晶，抽濾，濾液經(jīng)常壓蒸餾出甲醇，然后減壓真空干燥得粗品，用乙酸乙酯精制，即得白色固體粉末萊克多巴胺(終產(chǎn)物)20.85g，該物質(zhì)的熔點mp為167-168℃。此步收率94％。

檢測^[1]

1 免疫分析方法

免疫分析方法是利用抗原與抗體特異性反應(yīng)為基礎(chǔ)的分析技術(shù)，主要包括酶聯(lián)免疫法、膠體金免疫層析法、熒光微球免疫層析技術(shù)和時間分辨熒光免疫分析技術(shù)等。

1）酶聯(lián)免疫法

酶聯(lián)免疫法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)是基于競爭性酶聯(lián)反應(yīng)原理，把抗原-抗體免疫反應(yīng)的特異性和酶的高效催化作用有機結(jié)合起來的一種檢測技術(shù)，目前廣泛應(yīng)用于萊克多巴胺殘留的檢測。ELISA法檢測動物性食品中的萊克多巴胺，最低檢測限可達0.1ng/mL，平均回收率在70%～90%之間。ELISA 法具有快速、靈敏和高通量等特點，且無需昂貴的儀器，是目前基層檢測部門應(yīng)用的主要方法，一般用來進行大批量樣品的初步篩選，但該方法穩(wěn)定性差，出現(xiàn)的假陽性較多，需用氣相質(zhì)譜或液相質(zhì)譜進行確證。

2）膠體金免疫層析技術(shù)

膠體金免疫層析技術(shù)(gold immunochromatographyassay，GICA)是近年來興起的一種快速檢測技術(shù)，該技術(shù)是一種將膠體金顆粒與包括抗原、抗體在內(nèi)的許多蛋白質(zhì)標(biāo)記形成免疫金復(fù)合物的技術(shù)?；谀z體金免疫層析法研制出的試紙條，可在8～10min內(nèi)完成萊克多巴胺測試，檢測限為5ng/mL，肉眼即可判斷[10]。膠體金免疫層析技術(shù)具有簡單、快速、特異、靈敏的特點，不需要借助相關(guān)儀器，檢測效率能得到很大提高，適合大規(guī)模樣品的現(xiàn)場檢測。

3）熒光微球免疫層析技術(shù)

熒光微球免疫層析方法比膠體金免疫層析方法具有更高的靈敏度。劉道峰等[11]以熒光微球為新型標(biāo)記物，采用EDC法進行偶聯(lián)，制備了萊克多巴胺抗體熒光微球復(fù)合物，并以之為探針對萊克多巴胺進行檢測，檢測限為2.5ng/mL，且特異性強、檢測范圍寬。

4）時間分辨熒光免疫分析技術(shù)

時間分辨熒光免疫測定(time-resolved fluoroimmunoassay，TRFIA)是一種非同位素免疫分析技術(shù)，它用鑭系元素標(biāo)記抗原或抗體，根據(jù)鑭系元素螯合物的發(fā)光特點，用時間分辨技術(shù)測量熒光，同時檢測波長和時間兩個參數(shù)進行信號分辨，可有效地排除非特異熒光的干擾，極大地提高了分析靈敏度。TRFIA作為一項新興的超微量標(biāo)記免疫技術(shù)，其靈敏度比ELISA法更高、穩(wěn)定性更好，目前已有其應(yīng)用于萊克多巴胺檢測的報道。

2.色譜分析技術(shù)

色譜分析技術(shù)是萊克多巴胺檢測中常用的定量和確證方法，主要包括高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)和液相色譜-質(zhì)譜法(HPLCMS)等。

1）高效液相色譜法

萊克多巴胺的HPLC法檢測主要是采用SPE固相萃取小柱凈化，二極管陣列檢測器(diode array detector，DAD或熒光檢測器(fluorescence detector，F(xiàn)LD)檢測。由于萊克多巴胺的紫外吸收波長在224nm左右，采用HPLC-DAD對萊克多巴胺進行檢測時，在此波長附近干擾較大，通常不采用DAD檢測器檢測。萊克多巴胺含酚羥基，具有熒光性，可采用FLD檢測器測定，激發(fā)波長約為226nm，發(fā)射波長約為305nm，該方法靈敏，檢出限可達0.3μg/L，同時可排除雜質(zhì)干擾。

2）氣相色譜-質(zhì)譜法

萊克多巴胺化學(xué)結(jié)構(gòu)中具有不易氣化的羥基和氨基，屬于高沸點、難揮發(fā)的化合物，衍生后才能測定。常用的衍生劑有BSTFA(雙三甲基硅烷基三氟乙酰胺)和BSTFA+1%TMCS(三甲基氯硅烷)，衍生溫度為80℃左右，衍生時間為1h。采用GC-MS對豬肝臟中萊克多巴胺檢測的檢出限和定量限分別為0.5ng/g和2.0ng/g，對豬尿的檢出限和定量限分別為0.3μg/L和1.0μg/L。GC-MS是萊克多巴胺檢測最常用的定量和確證方法，但是它需要衍生，衍生效率對測定結(jié)果影響很大，因此加標(biāo)回收率不高，同時衍生劑和甲苯有極強的毒性。

3）液相色譜-質(zhì)譜法

液相色譜-質(zhì)譜法不需要衍生，采用內(nèi)標(biāo)法定量，在提高效率的同時提高檢測的準(zhǔn)確度，采用UPLC-ESIMS-MS對牛肉中的萊克多巴胺的檢出限和定量限分別為0.07μg/kg和0.22μg/kg。液相質(zhì)譜法靈敏度高，重現(xiàn)性強，適用于萊克多巴胺的確證檢測，但是其分析成本昂貴，難以普及。

3. 傳感器技術(shù)

1）生物傳感器技術(shù)

近年來，表面等離子體共振(SPR)生物傳感器受到人們的關(guān)注，原理為將能夠與待測物結(jié)合的物質(zhì)固定在傳感器芯片上，當(dāng)待測物流過芯片表面時與芯片表面的物質(zhì)結(jié)合，引起芯片表面光學(xué)參數(shù)變化，并以電信號的形式表現(xiàn)出來。該技術(shù)可在15min內(nèi)完成單個樣品的萊克多巴胺檢測，檢出限達0.6μg/kg。

該技術(shù)無需對分子進行標(biāo)記，方法的建立和樣品預(yù)處理簡單，所需樣品量少，可利用動力學(xué)特性繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測時間短，可分析弱相互作用或瞬間相互作用，可實時檢測。

2）電化學(xué)傳感器技術(shù)

采用Nafion-Au-Nafi on修飾玻碳電極，建立了萊克多巴胺的循環(huán)伏安電化學(xué)傳感方法，在pH2.0、B-R為支持液、富積時間120s、掃描速度50mV/s、電位1.1V條件下，檢測限可達2μg/L，檢測時間不超過5min。

4. 分子印跡技術(shù)

分子印跡技術(shù)的原理是：當(dāng)模板分子(印跡分子)與聚合物單體接觸時會形成多重作用點，通過聚合過程這種作用就會被記憶下來，當(dāng)模板分子除去后，聚合物中就形成了與模板分子空間構(gòu)型相匹配的具有多重作用點的空穴，這樣的空穴將對模板分子及其類似物具有選擇識別特性。分子印跡技術(shù)具有預(yù)定性、識別性和實用性等特點，目前廣泛應(yīng)用于色譜技術(shù)(固相萃取前處理)、酶聯(lián)免疫技術(shù)、電化學(xué)傳感器技術(shù)中，對動物性食品中的萊克多巴胺進行檢測。

5. 光譜技術(shù)

近年來，光譜技術(shù)用于鹽酸萊克多巴胺的檢測也有了新的進展，主要是表面增強拉曼光譜技術(shù)和太赫茲時域光譜。將表面增強拉曼散射光譜(SERS)用于豬尿中萊克多巴胺的檢測，樣品中的萊克多巴胺采用液液萃取LLE)和液液萃取-固相萃取(LLE-SPE)兩種方式提取后分別進行SERS檢測，檢測限分別為0.8μg/mL和0.4μg/mL。SERS技術(shù)測量樣品的制備方法簡單，具有很大的潛力，可用于快速分析的豬尿中萊克多巴胺。

6.化學(xué)發(fā)光法

根據(jù)堿性介質(zhì)中萊克多巴胺對魯米諾-鐵氰化鉀體系化學(xué)發(fā)光的增敏作用，建立了新的流動注射-化學(xué)發(fā)光快速測定萊克多巴胺的方法，相對發(fā)光強度與萊克多巴胺質(zhì)量濃度在0.004～0.8μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，檢出限為2.5μg/kg。

參考文獻

[1]石晶,王毅謙,吳福平,郭旸.動物性食品中萊克多巴胺檢測方法研究進展[J].肉類研究,2013,27(04):44-47.

[2] CN201110004968.8 β-腎上腺激動素萊克多巴胺的合成方法