背景[1-3]
大鼠甲硫氨酸亞砜還原酶B1(MSRB1)ELISA試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測定標(biāo)本中大鼠甲硫氨酸亞砜還原酶B1(MSRB1)水平。用純化的大鼠甲硫氨酸亞砜還原酶B1(MSRB1)抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入大鼠甲硫氨酸亞砜還原酶B1(MSRB1)，再與HRP標(biāo)記的大鼠甲硫氨酸亞砜還原酶B1(MSRB1)抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過徹底洗滌后加底物TMB顯色。
TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的大鼠甲硫氨酸亞砜還原酶B1(MSRB1)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），通過標(biāo)準曲線計算樣品中大鼠甲硫氨酸亞砜還原酶B1(MSRB1)濃度。
檢測原理：
結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性，酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性，又保留酶的活性。在測定時，受檢標(biāo)本（測定其中的抗體或抗原）與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與液體中的其他物質(zhì)分開。再加入酶標(biāo)記的抗原或抗體，也通過反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。
此時固相上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應(yīng)的結(jié)果，使測定方法達到很高的敏感度。ELISA可用于測定抗原，也可用于測定抗體。
應(yīng)用[4][5]
用于巨噬細胞MsrA對動脈粥樣硬化的干預(yù)研究
甲硫氨酸亞砜還原酶A(MsrA)能特異性地還原Met氧化產(chǎn)物——甲硫氨酸亞砜(MetSO),是一類進化保守、普遍存在的細胞內(nèi)抗氧化酶。
方法：構(gòu)建含hMsrA的pWPI重組慢病毒載體,以含綠色熒光蛋白GFP的空載體為對照,分別與包裝質(zhì)粒A8.91和包膜質(zhì)粒pD2G共轉(zhuǎn)染293t細胞系,包裝病毒顆粒,高速離心濃縮后檢測病毒滴度。體外實驗：將慢病毒顆粒以適宜的MOI(Multiplicity of infection)感染小鼠原代腹腔巨噬細胞和傳代RAW264.7巨噬細胞系,觀察高表達hMsrA對oxLDL刺激下巨噬細胞生物學(xué)功能的影響。
采用油紅O染色評價細胞泡沫化狀態(tài)：熒光探針DCF檢測細胞ROS水平；ELISA法檢測炎癥因子TNF-α、IL-6的分泌；RT-PCR和Western Blotting方法檢測脂質(zhì)轉(zhuǎn)運相關(guān)蛋白ABCA1、ABCG1、SRBI和LXR的轉(zhuǎn)錄和表達水平。
體內(nèi)實驗：慢病毒載體體外感染小鼠骨髓造血干細胞(HPCs),通過骨髓移植技術(shù)將其回輸?shù)絘poE-/-受體鼠中,小鼠高脂飲食12周后安樂死,檢測小鼠血漿脂質(zhì)含量(TC、TG)、炎癥水平(TNF-α、IL-6、MCP-1)、抗氧化酶活性(PON1、SOD)及HPCs和脾臟中hMsrA表達水平。并通過對小鼠主動脈竇的冰凍切片及油紅O染色,胸腹主動脈段en face剖面分析,評價hMsrA對動脈粥樣斑塊的影響。結(jié)果：成功構(gòu)建慢病毒顆粒LV-hMsrA,基因測序及蛋白印跡法分別證實了目的蛋白hMsrA的堿基序列和蛋白表達均沒有發(fā)生突變。
氧化應(yīng)激條件下,巨噬細胞高表達hMsrA可以顯著降低細胞內(nèi)的脂質(zhì)沉積和ROS水平,抑制細胞炎癥因子IL-6和TNF-a的分泌(P<0.05)。與LV-GFP組細胞相比,LV-hMsrA組細胞的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運相關(guān)蛋白ABCG1、LXR、ABCA1和SRBI的mRNA和蛋白水平都有顯著提高(P<0.05)。而無刺激培養(yǎng)下,細胞內(nèi)高表達hMsrA對ABCA1、ABCG1、SRBI和LXR均沒有影響(P>0.05)。
參考文獻
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[3]Accuracy and Biological Variation of Human Serum Paraoxonase 1 Activity and Polymorphism(Q192R)by Kinetic Enzyme Assay.Richard W.Browne,Stephen T.Koury,Susan Marion,Gregory Wilding,Paola Muti,Maurizio Trevis.Clinical Chemistry.2007
[4]Tumor-specific dendritic cells generated by genetic redirection of Toll-like receptor signaling against the tumor-associated antigen,erbB2.Y Xu,P K Darcy,M H Kershaw.Cancer Gene Therapy.2007
[5]周赤燕.巨噬細胞MsrA對動脈粥樣硬化的干預(yù)研究[D].武漢大學(xué),2013.