背景及概述[1]
氨基甲酸乙酯（Ethyl carbamate，簡稱EC），是一種具有遺傳毒性及致癌性的物質(zhì)，對嚙齒類動物，可導致肺癌、淋巴癌、肝癌和皮膚癌等疾病。EC廣泛存在于發(fā)酵食品（如醬油、腐乳等）、釀造酒（如黃酒、清酒、葡萄酒、蘋果酒等）和蒸餾酒（如白蘭地、威士忌等）中，主要通過酒精類飲料的攝入進入人體內(nèi)。研究表明氨基甲酸乙酯在生物體內(nèi)約有0.5%被細胞色素P450氧化為乙?；被姿嵋阴?，再進一步形成乙?；被姿嵋阴キh(huán)氧化物，此種物質(zhì)能夠在生物體內(nèi)形成DNA加聚物，導致DNA結(jié)構的雙鏈被破壞，進而導致細胞癌變；另有0.1%左右的氨基甲酸乙酯被細胞色素P450氧化為N-羥基氨基甲酸乙酯，這種物質(zhì)誘導Cu2+調(diào)控的DNA損傷，引起癌變。
早在1985年，加拿大衛(wèi)生與預防部門對酒精類飲料中的氨基甲酸乙酯含量做了強制性限量標準，隨后世界其他國家也先后制定了各種飲料酒中的限量標準。同時，采取減少和去除食品中EC前體物質(zhì)、選用選擇性強和特性良好的能降低發(fā)酵過程中尿素排泄量的菌株、對發(fā)酵過程和蒸餾過程進行工藝改良、對發(fā)酵酒進行脲酶和EC降解酶酶法后處理等方法降低成品中EC的含量。各種檢測飲料酒以及其他發(fā)酵食品中氨基甲酸乙酯含量的方法也不斷發(fā)明和改善。
現(xiàn)階段檢測氨基甲酸乙酯含量的方法主要有：薄層分析法、傅立葉變換近紅外光譜法(FTIR)，近紅外光譜技術(NIR)，氣相色譜分析法(GC)，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)，氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(GC/MS/MS)，氣相二維或多維色譜-穩(wěn)定同位素稀釋質(zhì)譜聯(lián)用技術(GC/GC/CIMS)，氣相色譜/熱離子檢測器法(GC/TSD)，高效液相色譜(HPLC)以及高效液相-熒光法(HPLC-FLD)，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC/MS/MS)等。
含量檢測[1]
CN201410533042.1報道了一種快速檢測氨基甲酸乙酯含量的分光光度方法，步驟為：
（1）構建雙酶偶聯(lián)催化體系
a、酶源：氨基甲酸乙酯降解酶，對氨基甲酸乙酯EC降解酶產(chǎn)生菌菌株CGMCC NO.5763細胞培養(yǎng)后經(jīng)超聲破碎、離心、濃縮、凝膠層析、超濾濃縮后所得；谷氨酸脫氫酶則為市售商品酶；
b、酶液以及其他溶液的制備：用25mmol·L-1 PBS緩沖液溶解氨基甲酸乙酯降解酶以及谷氨酸脫氫酶，使得二者酶活分別為16U·mL-1和10U·mL-1；配制540mmol·L-1α-酮戊二酸溶液；7.5mmol·L-1NADH以及不同濃度的氨基甲酸乙酯標準溶液；
c、雙酶偶聯(lián)體系的構建：向反應體系中分別加入20μL上述氨基甲酸乙酯降解酶和谷氨酸脫氫酶溶解液，66μL的α-酮戊二酸溶液，20μL NADH溶液，20μL 1mmol·L-1氨基甲酸乙酯溶液和454μL PBS緩沖液，使得總反應體系體積為600μL，置于石英比色皿中混合均勻；然后將此反應體系置于分光光度計中用動力學方法監(jiān)測溶液中NADH在340nm處吸光值的變化情況；
（2）雙酶偶聯(lián)體系對氨基甲酸乙酯含量的快速測定：
d、用純度大于99%的氨基甲酸乙酯配制濃度為0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5和1 mmol·L-1的母液；
e、向雙酶偶聯(lián)體系中加入適當體積和濃度的氨基甲酸乙酯母液使得反應體系中氨基甲酸乙酯濃度分別為0、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、30、40、50 μmol·L-1；將所得的溶液體系混合均勻后置于分光光度計中用動力學方法監(jiān)測NADH在340 nm處吸光值的變化，反應時間為5min；將EC的濃度與340nm處吸光值在5min內(nèi)的變化制作得到標準曲線，如圖2所示；
f、向模擬黃酒樣品（通過向pH 6.0，25 mmol·L-1PBS緩沖液中添加無水乙醇制備模擬黃酒，酒精度為15%）中添加一定量的氨基甲酸乙酯母液，在雙酶偶聯(lián)反應體系中反應5 min后檢測NADH在340nm處的吸光值變化，通過對比標準曲線計算模擬酒樣中氨基甲酸乙酯含量。
建立的方法能夠快速檢測并準確定量溶液樣品中的氨基甲酸乙酯含量。在模擬黃酒樣品中的檢測限為0.1 μmol·L-1，線性相關系數(shù)為0.995，樣品回收率為95.54%-100.01%，相對標準差為1.634%-4.611%（表1）。
表1檢測模擬黃酒樣品中氨基甲酸乙酯的回收率以及相對標準差
本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明通過對雙酶偶聯(lián)體系中最適緩沖體系、氨基甲酸乙酯降解酶和谷氨酸脫氫酶最適添加量、α-酮戊二酸最適反應濃度等多個實驗條件進行優(yōu)化，建立了快速實時檢測氨基甲酸乙酯含量的分光光度方法。該方法具有靈敏、快速、簡捷、無需昂貴的儀器和復雜繁瑣的操作工序等優(yōu)點，克服了以往方法中的諸多不足。
參考文獻
[1] [中國發(fā)明,中國發(fā)明授權] CN201410533042.1 一種快速檢測氨基甲酸乙酯含量的分光光度方法