背景[1-3]
絲狀真菌蛋白提取試劑盒適用于從各種絲狀真菌中提取總蛋白。優(yōu)化的裂解液配方可以充分釋放各種有隔膜菌絲和無隔膜菌絲蛋白以及各種菌絲變態(tài)體蛋白，提取過程簡單方便，可在1小時內完成。
絲狀真菌蛋白電泳膠圖
絲狀真菌蛋白提取試劑盒含有的蛋白酶抑制劑混合物，阻止了蛋白酶對蛋白的降解，為提取高純度的蛋白提供了保證。提取的蛋白用于二維電泳、報告基因檢測、SDS-PAGE電泳檢測、Western blotting、凝膠阻滯實驗、免疫共沉淀、酶活分析等下游實驗。
使用方法：
1．提取液準備：
每500μl提取液A中加入2μl蛋白酶抑制劑混合物，充分混勻后置冰上備用。
2．取100-300mg真菌組織樣本，用PBS洗一次。離心收集菌體沉淀。
3．在菌體沉淀中加入500μl提取液A，用勻漿機/勻漿器充分勻漿。
4．將勻漿液在500g離心5分鐘，棄沉淀，收集上清。
5．在上清中加入100μl提取液B，充分混勻。
6．將提取液在2-8℃振蕩30-40分鐘。
7．將提取液在4℃下12000-16000×g條件下離心10分鐘，棄沉淀。
8．將上清吸入另一預冷的干凈離心管，即可得到胞漿蛋白。
9．將上述蛋白提取物定量后分裝于-80℃冰箱保存?zhèn)溆没蛑苯佑糜谙掠螌嶒灐?/p>
應用[4][5]
用于絲狀真菌纖維素酶高產(chǎn)菌株遺傳改造及p24蛋白家族研究研究
針對位于絲狀真菌分泌路徑上p24蛋白進行生理功能研究。
1草酸青霉JUA10-1胞外木質纖維素降解酶系的理性改造通過同源比對確定草酸青霉中纖維素酶轉錄抑制因子有creA和acel。利用凝膠阻滯遷移實驗證明草酸青霉CreA結合結構域能和cel7a啟動子-216----446區(qū)發(fā)生結合,Acel結合結構域和cel7a啟動子-446----643區(qū)發(fā)生結合。
采用轉錄抑制因子creA和acel的結合結構域加上轉錄激活因子xlnR的效應結構域組成人工激活元件,導入到草酸青霉JUA10-1中,構建成功草酸青霉纖維素酶高產(chǎn)菌株CXA。
在流加葡萄糖的合成培養(yǎng)基中,FPase、pNPCase、pNPGase和胞外蛋白分泌量分別是出發(fā)株的1.14,1.12,1.64和1.39倍,同時主要纖維素酶,半纖維素酶基因在轉錄水平都有明顯提高。
在流加生物質水解液的工業(yè)化廉價培養(yǎng)基培養(yǎng)時,草酸青霉pNPCase,pNPGase和CMCase是出發(fā)菌株的1.32,1.56和1.10倍,同時在轉錄水平上驗證主要纖維素酶基因表達量也提高。這說明構建的纖維素酶高產(chǎn)菌株草酸青霉CXA具有很好的工業(yè)應用前景。
2草酸青霉和里氏木霉p24同源蛋白Erp生理功能比較p24蛋白家族是位于真核細胞內膜系統(tǒng)上小分子的跨膜蛋白。在酵母和果蠅中,其主要作用為參與物質選擇性運輸及質量控制。
在絲狀真菌中對p24y家族同源蛋白Erp進行生理功能研究并發(fā)現(xiàn)了一種新的纖維素酶轉錄激活機制。通過序列比對發(fā)現(xiàn)草酸青霉pErp和里氏木霉tErp蛋白氨基酸序列相似性達75%以上,但是Erp在兩株菌株中參與的生理路徑明顯不同。
形態(tài)發(fā)生方面：里氏木霉tErp參與分生孢子生成,細胞膜完整性維持及菌絲極性形成；草酸青霉pErp參與維持細胞膜完整性及菌絲側枝成熟。蛋白分泌方面,敲除erp基因后兩株菌內部都會造成分泌壓力,但兩種菌株轉錄水平響應機制明顯不同：里氏木霉下調相應基因表達；草酸青霉上調相應基因表達。
參考文獻
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[2]Plant Cell Wall–Degrading Enzymes and Their Secretion in Plant-Pathogenic Fungi[J].Christian P.Kubicek,Trevor L.Starr,N.Louise Glass.Annual Review of Phytopathology.2014
[3]A comparative systems analysis of polysaccharide‐elicited responses in N eurospora crassa reveals carbon source‐specific cellular adaptations[J].J.Philipp Benz,Bryant H.Chau,Diana Zheng,Stefan Bauer,N.Louise Glass,Chris R.Somerville.Molecular Microbiology.2014(2)
[4]Penicillium decumbens BrlA extensively regulates secondary metabolism and functionally associates with the expression of cellulase genes[J].Yuqi Qin,Longfei Bao,Meirong Gao,Mei Chen,Yunfeng Lei,Guodong Liu,Yinbo Qu.Applied Microbiology and Biotechnology.2013(24)
[5]王方忠.絲狀真菌纖維素酶高產(chǎn)菌株遺傳改造及p24蛋白家族研究[D].山東大學,2014.