背景[1-3]
HBL-1[HUMAN DIFFUSE LARGE B-CELL LYMPHOMA]人彌漫大B淋巴瘤細胞系 是指從人彌漫大B淋巴瘤的組織或器官經(jīng)胰蛋白酶、膠原酶、中性蛋白酶或其它的方法獲得單個細胞并在體外進行模擬機體環(huán)境培養(yǎng)的細胞。
一般認為，培養(yǎng)的原代的第1代細胞和傳代到第10代以內(nèi)的細胞統(tǒng)稱為原代細胞培養(yǎng)。原代細胞不僅廣泛應(yīng)用于分子生物學、細胞生物學和生物醫(yī)學基礎(chǔ)研究，還可應(yīng)用于當今熱門的生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)，如藥物篩選、藥物代謝和毒理研究、癌癥藥物的研究等。
HBL-1 [HUMAN DIFFUSE LARGE B-CELL LYMPHOMA] 人彌漫大B淋巴瘤細胞系
細胞復(fù)蘇操作：
1、將培養(yǎng)基在37℃水浴鍋預(yù)熱；準備一個15mL無菌的離心管，加入8mL預(yù)熱培養(yǎng)基。
2、將凍存細胞從液氮罐中取出，快速放入37℃水浴鍋中復(fù)溫（可準備一潔凈的燒杯，裝滿37℃的水，細胞凍存管取出后迅速放入燒杯內(nèi)，再逐步轉(zhuǎn)移到水浴鍋中）。輕輕晃動凍存管，使細胞能在1~2min內(nèi)完全解凍，使細胞能盡快通過易受損的溫度段（-5~0℃）。注意凍存管管口不能沒入水中，避免引起污染。
3、用75%酒精擦拭凍存管后再置于超凈臺內(nèi)，將管內(nèi)細胞轉(zhuǎn)移至準備好的離心管內(nèi)，輕輕吹打液體，使細胞均勻分散，降低DMSO濃度，吹打時避免產(chǎn)生氣泡。用新鮮培養(yǎng)基洗管壁2次，均轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)。
4、800rpm離心5min，棄上清，加入新鮮的培養(yǎng)基，吹打制成細胞懸液。
5、將細胞懸液轉(zhuǎn)移至T25細胞瓶內(nèi)，補加適量的培養(yǎng)基，輕輕晃動細胞瓶使細胞分布均勻，放入溫箱內(nèi)培養(yǎng)。
6、第二天觀察細胞貼壁生長情況，換新鮮培養(yǎng)基以去除死細胞。繼續(xù)培養(yǎng)，待細胞長至80~90%匯合時正常傳代。一般剛復(fù)蘇的細胞需經(jīng)過2~3次傳代，細胞活力恢復(fù)后才能進行后續(xù)的實驗。
應(yīng)用[4][5]
用于miR-150再表達通過靶向c-Myb誘導EBV陽性Burkitt淋巴瘤分化研究
1. 觀測hsa-miR-150和c-Myb在人類正常不同分化階段B淋巴細胞和不同淋巴瘤細胞系表達譜。
2. 構(gòu)建Burkitt淋巴瘤細胞株穩(wěn)定表達hsa-miR-150細胞亞系Raji-miR-150,Daudi-miR-150,Ramos-miR-150和BJAB-miR-150。
3. 探究miR-150再表達誘導Burkitt淋巴瘤細胞向末端漿細胞方向分化的可能性及其機制。
方法1.hsa-miR-150和c-Myb在人類正常不同分化階段B淋巴細胞亞群和不同淋巴瘤細胞系表達模式采用流式細胞技術(shù)從扁桃體炎患者中的扁桃體內(nèi)分選出不同分化階段B淋巴細胞群,包括naive細胞,中心母細胞,中心細胞和記憶B細胞；運用real-time PCR檢測hsa-miR-150和c-Myb在正常不同分化階段B淋巴細胞群和各株淋巴瘤細胞中的表達水平；利用Western Blot在蛋白水平檢測正常B細胞各株淋巴瘤細胞c-Myb的表達水平。
2. 穩(wěn)定表達hsa-miR-150的Burkitt淋巴瘤細胞亞系Raji-miR-150,Daudi-miR-150,Ramos-miR-150和BJAB-miR-150的構(gòu)建及其生物學特性含目的基因（hsa-miR-150）的慢病毒表達載體購自上海吉凱公司；將含有重組慢病毒質(zhì)粒（實驗組,對照組）的病毒上清分別轉(zhuǎn)染Burkitt淋巴瘤細胞亞系Raji,Daudi,Ramos和BJAB細胞系,并命名為Raji-miR-150,Daudi-miR-150,Ramos-miR-150和BJAB-miR-150細胞,實驗組和對照組均帶有GFP標簽,對照組分別命名為Raji-GFP,Daudi-GFP,Ramos-GFP和BJAB-GFP細胞。
利用流式細胞技術(shù)根據(jù)GFP的表達篩選出陽性細胞。對新構(gòu)建的細胞亞系,通過real-time PCR檢測實驗組和對照組miR-150的表達；流式細胞技術(shù)檢測細胞增殖和凋亡,MTT法檢測細胞增殖。
參考文獻
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[2]Burkitt’s lymphoma[J].Elizabeth M Molyneux,Rosemary Rochford,Beverly Griffin,Robert Newton,Graham Jackson,Geetha Menon,Christine J Harrison,Trijn Israels,Simon Bailey.The Lancet.2012(9822)
[3]CD99 triggers upregulation of miR‐9‐modulated PRDM1/BLIMP1 in Hodgkin/Reed–Sternberg cells and induces redifferentiation[J].Xueping Huang,Xinhua Zhou,Zhiqiang Wang,Feng Li,Fanrong Liu,Lin Zhong,Xiangzhao Li,Xiqun Han,Ziqing Wu,Shaohong Chen,Tong Zhao.Int.J.Cancer.2011(4)
[4]Plasma cell development and survival[J].Sarah A.Oracki,Jennifer A.Walker,Margaret L.Hibbs,Lynn M.Corcoran,David M.Tarlinton.Immunological Reviews.2010(1)
[5]陳少紅.miR-150再表達通過靶向c-Myb誘導EBV陽性Burkitt淋巴瘤分化[D].南方醫(yī)科大學,2013.