背景[1-3]
SK-MEL-1人皮膚黑色素瘤細(xì)胞是由Oettgen·F及其同事從一名29歲的患有廣泛、快速進(jìn)展性惡性黑色素瘤的白人男性患者的胸導(dǎo)管中分離建立的。SK-MEL-1細(xì)胞可產(chǎn)生黑色素，電鏡檢測發(fā)現(xiàn)SK-MEL-1細(xì)胞中色素顆粒與自身合成和吞噬作用相關(guān)。在63%的惡性黑色素瘤患者和10%其他疾病患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了針對SK-MEL-1細(xì)胞的抗體。
SK-MEL-1 人皮膚黑色素瘤細(xì)胞
培養(yǎng)步驟
1）復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入5mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心5分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加4-6mL完全培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入6cm皿中），培養(yǎng)過夜。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。
2）細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
傳代方法：
1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。
2.加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2min，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加5ml以上含10%血清的完全培養(yǎng)基終止消化。
3.輕輕吹打細(xì)胞，完全脫落后吸出，在1000RPM條件下離心8-10分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。
4.按5-6ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)液，將細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含5-6 ml培養(yǎng)液的新皿中或者瓶中。
應(yīng)用[4][5]
用于microRNA-33a通過靶向HIF-1α抑制黑色素瘤侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制研究
通過real-time PCR法檢測miR-33a/b在低轉(zhuǎn)移侵襲力的皮膚黑色素瘤細(xì)胞株WM35及高轉(zhuǎn)移侵襲力的皮膚黑色素瘤細(xì)胞株WM451、A375和SK-MEL-1中的表達(dá)量。明確miR-33a/b在黑色素瘤細(xì)胞系中的表達(dá)情況,篩選miR-33a/b高表達(dá)和低表達(dá)的黑色素瘤細(xì)胞系作為進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究對象。
構(gòu)建pYr-LVX-pri-miR-33a慢病毒載體,并將其包裝成慢病毒,然后感染A375細(xì)胞,建立hsa-miR-33a穩(wěn)定過表達(dá)細(xì)胞系A(chǔ)375-pYr-LVX-pir-miR-33a;構(gòu)建pYr-LVX-miR-33a-sponge慢病毒載體,并將其包裝成慢病毒,然后分別感染W(wǎng)M35、WM451細(xì)胞,建立hsa-miR-33a表達(dá)抑制的穩(wěn)定細(xì)胞系WM35-pYr-LVX-miR-33a-sponge和、VM451-pYr-LVX-miR-33a-sponge o以1niR-33a表達(dá)穩(wěn)定上調(diào)／抑制細(xì)胞系為研究對象,運(yùn)用MTT法檢測細(xì)胞增殖能力。
平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞克隆數(shù)；流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率；細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移侵襲力；、Vestern Blot法檢測與EMT相關(guān)的E-鈣粘連蛋白（E-Cadherin）、N-鈣粘連蛋白（N-Cadherin）的表達(dá)情況。多層面探討miR-33a的表達(dá)對細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、侵襲轉(zhuǎn)移和EMT等表型的影響。
通過皮下接種及尾靜脈注射A375及A375-pYr-LVX-pir-miR-33a細(xì)胞建立裸鼠種植瘤及移植瘤模型,觀察裸鼠皮下種植瘤的大小、體積、質(zhì)量及肺臟轉(zhuǎn)移灶數(shù)目的變化情況。
采用生物信息學(xué)分析法預(yù)測HIF-1α可能為miR-33a的下游靶因；Western Blot法檢測miR-33a表達(dá)變化時HIF-1α蛋白的表達(dá)水平；應(yīng)用雙熒光素酶基因報(bào)告法進(jìn)一步驗(yàn)證HIF-1α是否為miR-33a的直接靶基因。
研究結(jié)果：miR-33a與1niR-33b在低轉(zhuǎn)移侵襲力的人皮膚黑色素瘤細(xì)胞株WM35中表達(dá)量均高,而在高轉(zhuǎn)移侵襲力的人皮膚黑色素瘤細(xì)胞株VM451、A375和SK-MEL-1中的表達(dá)量相對較低（WM35>WM451>A375>SK-MEL-1）;上調(diào)A375細(xì)胞株中1niR-33a的表達(dá)能抑制細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化；抑制WM451和WM35細(xì)胞株中miR-33a的表達(dá)能促進(jìn)細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化；miR-33a對細(xì)胞凋亡的影響無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
參考文獻(xiàn)
[1]MicroRNAs in malignant melanoma[J].Daniel V?ller,Corinna Ott,Anja Bosserhoff.Clinical Biochemistry.2013(10-1)
[2]miR-145 overexpression suppresses the migration and invasion of metastaticmelanoma cells[J].Peter Dynoodt,Reinhart Speeckaert,Olivier De Wever,Inès Chevolet,Lieve Brochez,Jo Lambert,Mireille Van Gele.International Journal of Oncology.2013(4)
[3]Let-7b and microRNA-199a inhibit the proliferation of B16F10 melanomacells[J].Dan Xu,Jianxiang Tan,Ming Zhou,Bimei Jiang,Huiqing Xie,Xinmin Nie,Kun Xia,Jianda Zhou.Oncology Letters.2012(5)
[4]The status of microRNA-21 expression and its clinical significance in human cutaneous malignant melanoma[J].Li Jiang,Xiaoxing Lv,Jing Li,Jinqing Li,Xueyong Li,Wangzhou Li,Yuejun Li.Acta Histochemica.2011(6)
[5]徐丹.microRNA-33a通過靶向HIF-1α抑制黑色素瘤侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制研究[D].中南大學(xué),2013.