背景[1-3]
大鼠視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞采用膠原酶-中性蛋白酶混合消化法結(jié)合密度梯度離心法、最后通過內(nèi)皮細(xì)胞專用培養(yǎng)基培養(yǎng)篩選制備而來，細(xì)胞經(jīng)CD31/vWF免疫熒光鑒定，純度可達(dá)90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細(xì)菌、酵母和真菌等。
大鼠視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞
大鼠視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞（Rat Retinal Microvascular Endothelial Cells）來源于成年大鼠視網(wǎng)膜組織，其是組成血管腔面單層扁平上皮樣細(xì)胞，它所產(chǎn)生和分泌的生物活性物質(zhì)對(duì)維持血管張力，調(diào)節(jié)血壓，抗血栓形成等有重要作用，在視網(wǎng)膜血管疾病的發(fā)病機(jī)制中有重要病理生理學(xué)意義。
使用方法：
收到細(xì)胞后，請(qǐng)按照以下方法進(jìn)行操作。
1.取出25cm2培養(yǎng)瓶，75%酒精消毒，拆下封口膜，放入37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置6-8小時(shí)或者過夜，以穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài)。
2.收集瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)基，每瓶細(xì)胞僅留8mL左右培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，然后根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪M(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
3.細(xì)胞傳代
1)吸出25cm2培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，用PBS清洗細(xì)胞一次；
2)添加0.125%胰蛋白酶消化液約1mL至培養(yǎng)瓶中，37℃溫浴3min左右；倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞回縮變圓后吸棄消化液，再加入完全培養(yǎng)液終止消化；
3)用吸管輕輕吹打混勻，按1:2或1:3等適當(dāng)?shù)谋壤M(jìn)行接種傳代，然后補(bǔ)充新鮮的完全培養(yǎng)基至5mL，放入37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
4)待細(xì)胞完全貼壁后，培養(yǎng)觀察。之后每隔2-3天更換新鮮的完全培養(yǎng)基。
應(yīng)用[4][5]
用于苦參堿對(duì)體外培養(yǎng)的大鼠視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖及VEGF表達(dá)的影響研究
研究苦參堿（Matrine,Mat）對(duì)體外培養(yǎng)的大鼠視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞（rat retinal microvascular endothelial cells,RRMECs）的增殖及VEGF表達(dá)的影響,明確其可否抑制視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖及下調(diào)VEGF的表達(dá),為視網(wǎng)膜新生血管的藥物防治提供新的思路和理論依據(jù)。
方法:原代培養(yǎng)RRMECs,取第三代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。MTT比色法檢測(cè)不同劑量Mat作用不同時(shí)間對(duì)RRMECs增殖的抑制作用;臺(tái)盼藍(lán)染色細(xì)胞計(jì)數(shù)法測(cè)定其對(duì)RRMECs生長(zhǎng)曲線的影響;AO/EB熒光雙染色法觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)的改變。
將RRMECs按如下分組處理:（1）陰性對(duì)照組:用含20%血清DMEM培養(yǎng);（2）陽性對(duì)照組:含20%血清DMEM+血管抑素130mg/L（3）Mat組:含20%血清DMEM+Mat 40mg/L;（4）高糖組:含20%血清高糖DMEM（葡萄糖濃度25mmol/L）;（5）Mat+高糖組。免疫細(xì)胞化學(xué)和Western-Blotting檢測(cè)不同分組處理48小時(shí)后細(xì)胞VEGF的表達(dá)。
結(jié)果:MTT比色法測(cè)定結(jié)果顯示:用5、10、20、40、80、160mg/L的Mat處理RRMECs,作用24h細(xì)胞增殖抑制率分別為1.42±1.03%、11.50±1.98%、24.98±2.38%、40.27±2.49%、53.54±2.39%、63.88±3.12%;作用48h細(xì)胞增殖抑制率分別為4.16±1.14%、14.40±1.78%、33.28±1.83%、53.61±1.32%、63.53±1.96%、73.79±1.12%;作用72h細(xì)胞增殖抑制率分別為9.83±2.13%、22.17±4.29%、42.65±1.05%、63.17±1.38%、74.35±2.60%、87.24±4.59%。在5mg/L以上各試驗(yàn)組與對(duì)照組相比均具有顯著性差異（P<0.05）,各試驗(yàn)組之間兩兩比較也具有顯著性差異（P<0.05）。
隨著濃度的增高,作用時(shí)間的增加,Mat抑制細(xì)胞增殖的作用越明顯,當(dāng)濃度達(dá)到40mg/L,作用48小時(shí),細(xì)胞抑制率超過了50%。細(xì)胞計(jì)數(shù)繪制生長(zhǎng)曲線結(jié)果與MTT結(jié)果相一致。
參考文獻(xiàn)
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