背景^[1-3]

大鼠胰島素(INS)ELISA試劑盒采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測樣本中胰島素(INS)的含量。

實(shí)驗(yàn)原理：在預(yù)包被抗大鼠胰島素（INS）抗體（固相抗體）的微孔酶標(biāo)板中，加入大鼠胰島素（INS）校準(zhǔn)品和待測樣本，再加入另一株HRP標(biāo)記的抗大鼠胰島素（INS）抗體（酶標(biāo)抗體），經(jīng)過溫育與充分洗滌，去除未結(jié)合的組分，在微孔板固相表面形成固相抗體-抗原-酶標(biāo)抗體的夾心復(fù)合物。加底物A和B，底物在HRP催化下，產(chǎn)生藍(lán)色產(chǎn)物，在終止液（2M硫酸）作用下，最終轉(zhuǎn)化為黃色，在酶標(biāo)儀上測定吸光度（OD值），吸光度（OD值）與待測樣品中大鼠胰島素（INS）的濃度正相關(guān)。擬合校準(zhǔn)品曲線，可以計算出樣本中大鼠胰島素（INS）的濃度。

大鼠胰島素(INS)ELISA試劑盒

試劑盒的組分：

（1）已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑）；

（2）酶標(biāo)記的抗原或抗體（結(jié)合物）；

（3）酶的底物；

（4）陰性對照品和陽性對照品（定性測定中），參閱標(biāo)準(zhǔn)品和控制血清（定量測定中）；

（5）結(jié)合物及標(biāo)本的稀釋液；

（6）洗滌液；

（7）酶反應(yīng)終止液。

操作步驟：

1.使用前，將所有試劑充分混勻。不要使液體產(chǎn)生大量的泡沫，以免加樣時加入大量的氣泡，產(chǎn)生加樣上的誤差。

2.根據(jù)待測樣品數(shù)量加上標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)。每個標(biāo)準(zhǔn)品和空白孔建議做復(fù)孔。每個樣品根據(jù)自己的數(shù)量來定，能使用復(fù)孔的盡量做復(fù)孔。標(biāo)本用標(biāo)本稀釋液1：1稀釋后加入50ul于反應(yīng)孔內(nèi)。

3.加入稀釋好后的標(biāo)準(zhǔn)品50ul于反應(yīng)孔、加入待測樣品50ul于反應(yīng)孔內(nèi)。立即加入50ul的生物素標(biāo)記的抗體。蓋上膜板，輕輕振蕩混勻，37℃溫育1小時。

4.甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復(fù)此操作3次。如果用洗板機(jī)洗滌，洗滌次數(shù)增加一次。

5.每孔加入80ul的親和鏈酶素-HRP，輕輕振蕩混勻，37℃溫育30分鐘。

6.甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復(fù)此操作3次。如果用洗板機(jī)洗滌，洗滌次數(shù)增加一次。

7.每孔加入底物A、B各50ul，輕輕振蕩混勻，37℃溫育10分鐘。避免光照。

8.取出酶標(biāo)板，迅速加入50ul終止液，加入終止液后應(yīng)立即測定結(jié)果。

9.在450nm波長處測定各孔的OD值。

應(yīng)用^[4][5]

用于壬基酚對SD大鼠胰腺結(jié)構(gòu)及胰島素分泌功能影響的體內(nèi)外研究

通過對SD雄性大鼠進(jìn)行亞慢性壬基酚灌胃染毒,結(jié)合INS-1（大鼠胰島β細(xì)胞株）細(xì)胞體外培養(yǎng)染毒,研究壬基酚對胰腺的毒性作用,探討造成胰腺損傷的可能機(jī)制,為進(jìn)一步的研究提供相關(guān)依據(jù)。

方法:32只6周齡清潔級的SD雄性大鼠,適應(yīng)性喂養(yǎng)一周,隨機(jī)分為4組:溶劑對照組（0mg/kg）、壬基酚低劑量染毒組（20mg/kg）、壬基酚中劑量染毒組（60mg/kg）和壬基酚高劑量染毒組（180mg/kg）,每組8只大鼠。染毒方式采用每天灌胃染毒,灌胃量維持在1ml左右,連續(xù)灌胃90天。

染毒結(jié)束后空腹12小時,經(jīng)腹腔注射麻醉,取腹主動脈血,分離新鮮胰腺組織進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn):

（1）采用免疫組織化學(xué)法檢測胰島面積,胰島α細(xì)胞、β細(xì)胞的相對容積以及β細(xì)胞與α細(xì)胞比率;

（2）采用蘇木精-伊紅（Hematoxylin and Eosin,HE）染色,觀察各組大鼠胰腺組織病理學(xué)改變;

（3）采用原位末端標(biāo)記法（TUNEL）檢測胰腺組織的細(xì)胞凋亡情況;

（4）采用割尾采血法檢測大鼠空腹血糖濃度,采用放射免疫法檢測腹主動脈血血清中胰島素與胰高血糖素的含量;

（5）胰腺組織經(jīng)消化后分離胰島,采用雙硫腙（DTZ）染色,檢測單位體積胰腺消化液中胰島的數(shù)量;

（6）采用胰島素釋放試驗(yàn)檢測胰島分泌胰島素的水平;

（7）以INS-1細(xì)胞作為體外實(shí)驗(yàn)研究對象,采用CCK-8法檢測不同濃度的壬基酚（0、0.025、0.25、2.5、25μmol/L）對INS-1細(xì)胞染毒后細(xì)胞存活率的影響;

（8）采用胰島素釋放試驗(yàn)檢測INS-1細(xì)胞經(jīng)不同濃度的壬基酚處理后的胰島素分泌功能。

參考文獻(xiàn)

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[4]Occurrence and Partitioning of Phenolic Endocrine-Disrupting Chemicals（EDCs）Between Surface Water and Suspended Particulate Matter in the North Tai Lake Basin,Eastern China[J].Yi-zhang Zhang,Wei Meng,Yuan Zhang.Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology.2014(2)

[5]李雪驥.壬基酚對SD大鼠胰腺結(jié)構(gòu)及胰島素分泌功能影響的體內(nèi)外研究[D].蘇州大學(xué),2017.