背景[1-3]
NK-92人惡性非霍奇金淋巴瘤患者的自然殺傷細胞是從一位患有急進性非霍奇金淋巴瘤的50歲白人男性外周血單核細胞衍生來的一株IL-2依賴型NK細胞株。NK-92MI細胞是轉(zhuǎn)染得到的源自NK-92細胞的IL-2非依賴的NK細胞株。
NK-92人惡性非霍奇金淋巴瘤患者的自然殺傷細胞
親本細胞NK-92通過微粒體基因轉(zhuǎn)化法用逆轉(zhuǎn)錄病毒MFG-hIL-2載體攜帶的人IL-2cDNA進行轉(zhuǎn)化?？赡苡捎谳d體整合到基因組DNA中，轉(zhuǎn)化是穩(wěn)定的。
這株細胞對很多惡性細胞有細胞毒性；鉻釋放試驗顯示它能殺死K562細胞和Daudi細胞。NK-92細胞有以下特征：CD2、CD7、CD11a、CD28、CD45、CD54表面標記陽性；CD1、CD3、CD4、CD5、CD8、CD10、CD14、CD16、CD19、CD20、CD23、CD34和HLA-DR表面標記陰性。
其親本IL-2依賴的細胞株NK-92細胞及另一株同樣來源于NK-92細胞株的IL-2非依賴的細胞株NK-92CI都可從ATCC得到。NK-92MI細胞和NK-92CI細胞這兩個變種都包含、表達并合成hIL-2cDNA。NK-92MI細胞合成的IL-2水平比NK-92CI高，而親本細胞不合成表達。
1998年9月提交到ATCC的培養(yǎng)物污染了支原體，其后代通過BM細胞周期蛋白處理21天消除支原體。處理后6周，用Hoechst染色、PCR和標準培養(yǎng)測試進行支原體檢測，結(jié)果都呈陰性。
生長培養(yǎng)基： MEMα＋0.2mM Inositol＋0.1mMβ-mercaptoethanol＋0.02mM Folic Acid＋12.5%HS＋12.5%FBS＋1%P/S；
培養(yǎng)條件氣相：空氣，95%；CO2，5%，溫度：37℃。
應(yīng)用[4][5]
用于紅桂木凝集素對B淋巴細胞、NK細胞生長的影響及其機制研究
以脾臟來源B細胞、NK92MI細胞為研究對象,觀察ALL對其生長的影響,并初步探索其機制,以期對ALL的免疫調(diào)控作用有新的認識,為其在臨床疾病防治等方面的開發(fā)應(yīng)用奠定良好的理論和實驗基礎(chǔ)。
方法:1.ALL對B細胞、NK92MI細胞增殖的影響1、ALL對B細胞增殖的影響無菌條件下取小鼠脾臟,采用Easy SepTM Mouse B cell isolation kit分離純化B淋巴細胞,將不同濃度紅桂木凝集素溶液分別作用B細胞72 h后,倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài),CCK-8法檢測B細胞的增殖抑制率。
2. ALL對NK92MI細胞增殖的影響常規(guī)培養(yǎng)人惡性非霍奇金淋巴瘤患者的自然殺傷細胞NK92MI細胞,NK92MI細胞經(jīng)不同濃度紅桂木凝集素溶液分別作用48 h后,倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài),CCK-8法檢測NK92MI細胞的增殖抑制率;FACS檢測細胞內(nèi)功能蛋白granzymeA、granzymeB、granulysin、perforin的表達。
ALL受體的初步分析FACS分析ALL與NK92MI細胞的結(jié)合;FACS分析半乳糖抑制ALL與NK92MI細胞的結(jié)合;FITC-ALL與PE-CD45雙染的FACS分析;ALL受體與CD45的共定位分析;ALL內(nèi)吞的觀察。
ALL誘導NK92MI細胞凋亡的機制研究常規(guī)培養(yǎng)人惡性非霍奇金淋巴瘤患者的自然殺傷細胞NK92MI細胞,NK92MI細胞經(jīng)不同濃度紅桂木凝集素溶液分別作用24h,Annexin-V/PI雙染檢測NK92MI細胞凋亡;透射電子顯微鏡觀察凋亡小體;PI染色法分析細胞亞二倍體。
FACS分析半乳糖對ALL誘導凋亡的抑制作用。熒光定量PCR分析凋亡相關(guān)基因的差異表達。FACS檢測Caspase-3、Cytochrome-c的表達,Caspase 3抑制劑Z-DEVD-FMK對ALL誘導凋亡的抑制作用。
參考文獻
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[5]尹利君.紅桂木凝集素對B淋巴細胞、NK細胞生長的影響及其機制研究[D].廣西醫(yī)科大學,2016.