背景[1-3]
人血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)ELISA試劑盒采用雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測樣本中血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)的含量。
原理：往預(yù)先包被人血管內(nèi)皮細胞生長因子（VEGF）捕獲抗體的包被微孔中，依次加入標本、標準品、HRP標記的檢測抗體，經(jīng)過溫育并徹底洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成終的黃色。顏色的深淺和樣品中的人血管內(nèi)皮細胞生長因子（VEGF）呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度。
人血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)ELISA試劑盒
操作步驟：
1. 從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。
2. 設(shè)置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50μL；
3. 待測樣本孔先加待測樣本10μL，再加樣本稀釋液40μL；
4. 隨后標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗體100μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。
5. 棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次（也可用洗板機洗板）。
6. 每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。
7. 每孔加入終止液50μL，15min內(nèi)，在450nm波長處測定各孔的OD值。
應(yīng)用[4][5]
用于血管內(nèi)皮細胞生長因子基因轉(zhuǎn)染成纖維細胞的實驗研究
（1）體外擴增人血管內(nèi)皮細胞生長因子165基因全長序列并構(gòu)建真核質(zhì)粒表達載體；（2）用重組載體轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的人胎兒成纖維細胞，得到轉(zhuǎn)基因細胞株；（3）對轉(zhuǎn)基因細胞進行初步研究，探討其直接應(yīng)用于創(chuàng)面移植及用于復(fù)合人工皮的構(gòu)建的可行性并為其提供原料。
（2）方法：（1）設(shè)計合成引物，抽提肝癌組織總RNA為模板，用RT-PCR方法體外擴增hVEGF165全長基因，并以穿梭質(zhì)粒pcDNA3為骨架，構(gòu)建真核表達載體pcDNA3-hVEGF165；
（3）用FeGENE6轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的人胎兒成纖維細胞，通過G418進行篩選，得到單克隆細胞，繼續(xù)培養(yǎng)擴增得到轉(zhuǎn)基因細胞株；
（4）通過一系列實驗對轉(zhuǎn)基因細胞進行初步研究：①將轉(zhuǎn)基因細胞消化收集，抽提總RNA，用RT-PCR方法檢測轉(zhuǎn)基因細胞VEGF基因的轉(zhuǎn)錄水平，并以正常細胞作對照；
②用ELISA方法檢測轉(zhuǎn)基因細胞培養(yǎng)上清液中VEGF表達的濃度和持續(xù)時間，評價外源基因翻譯水平和表達蛋白的分泌狀況；
③用轉(zhuǎn)基因細胞培養(yǎng)上清液培養(yǎng)血管內(nèi)皮細胞，通過測定血管內(nèi)皮細胞細胞生長曲線的改變，來檢測其表達蛋白的生物學(xué)活性；
④采用MTT方法對轉(zhuǎn)基因細胞的細胞增殖曲線進行測定；
⑤Miles實驗，通過檢測培養(yǎng)上清液對血管通透性的影響，檢測表達蛋白的生物學(xué)活性。
參考文獻
[1]Quantitative measurement of the splice variants 120 and 164 of the angiogenic peptide vascular endothelial growth factor in the time flow of fracture healing:a study in the rat[J].Thomas Pufe,Britt Wildemann,Wolf Petersen,Rolf Mentlein,Michael Raschke,Gerhard Schmidmaier.Cell and Tissue Research.2002(3)
[2]Vascularized pedicle bone-grafting for nontraumatic avascular necrosis of the femoral head A 5-to 11-year follow-up[J].Y.Hasegawa,H.Iwata,S.Torii,T.Iwase,K.Kawamoto,S.Iwasada.Archives of Orthopaedic and Trauma Surgery.1997(5)
[3]Current pathologic methods for measuring intratumoral microvessel density within breast carcinoma and other solid tumors[J].Noel Weidner.Breast Cancer Research and Treatment.1995(2)
[4]Effect of growth rate on stability and gene expression of a recombinant plasmid during continuous culture ofEscherichia coli in a non-selective medium[J].Nabil Nancib,Joseph Boudrant.Biotechnology Letters.1992(8)
[5]李剛.血管內(nèi)皮細胞生長因子基因轉(zhuǎn)染成纖維細胞的實驗研究[D].第二軍醫(yī)大學(xué),2002.