背景^[1-3]

HUTU-80細(xì)胞是來自一位53歲十二脂腸腺癌患者的上皮細(xì)胞樣貼壁細(xì)胞，每個HuTu-80細(xì)胞上，蛙皮素受體的位點(diǎn)多達(dá)6000個。生長培養(yǎng)基 MEM＋10%FBS＋1%P/S，培養(yǎng)條件氣相：空氣，95%；CO2，5%溫度：37℃。

HUTU-80細(xì)胞

培養(yǎng)步驟：

1）復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入5mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心5分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加4-6mL完全培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入6cm皿中），培養(yǎng)過夜。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2）細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。

2.加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2min，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加5ml以上含10%血清的完全培養(yǎng)基終止消化。

3.輕輕吹打細(xì)胞，完全脫落后吸出，在1000RPM條件下離心8-10分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。

4.按5-6ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)液，將細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含5-6 ml培養(yǎng)液的新皿中或者瓶中。

應(yīng)用^[4][5]

用于蓖麻毒蛋白誘導(dǎo)HuTu-80細(xì)胞凋亡的比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究

蓖麻毒素是蓖麻籽中存在的一種能使核糖體失活的高效蛋白質(zhì),并由A、B鏈構(gòu)成,A鏈?zhǔn)蔷哂蠳-糖苷酶活性的活性鏈,導(dǎo)致蛋白質(zhì)的合成受到抑制,引發(fā)細(xì)胞死亡；B鏈具有凝集素活性,能夠識別和結(jié)合細(xì)胞表面含有半乳糖結(jié)構(gòu)的受體,協(xié)助A鏈進(jìn)入細(xì)胞。

當(dāng)一個蓖麻毒素分子進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)時,就可以使整個細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成停止最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

研究通過比較蛋白質(zhì)組學(xué)的研究手段,用蓖麻毒蛋白誘導(dǎo)人十二指腸腺癌細(xì)胞（HuTu-80）,分析全蛋白差異表達(dá)的情況,為蓖麻毒蛋白在HuTu-80細(xì)胞中的作用機(jī)理提供新的試驗(yàn)窗口。

1. 研究首先采用硫酸銨鹽析法,從蓖麻種籽中提粗素,通過Sepharose4B柱親和層析和Sephacryl S-200柱凝膠過濾層析對其進(jìn)行純化,經(jīng)p-巰基乙醇處理,可見A鏈分子量為28KDa,B鏈的分子量為32KDa的蓖麻毒素。SDS-PAGE鑒定純化后的蓖麻毒素達(dá)到了電泳純。測定其濃度后,用獲得的蓖麻毒蛋白對HuTu-80細(xì)胞進(jìn)行ICso試驗(yàn)。結(jié)果表明：細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化,而IC50為200ng/ml。

2. 構(gòu)建蓖麻毒蛋白誘導(dǎo)HuTu-80細(xì)胞的凋亡模型,通過MTT排除試驗(yàn)、AO/EB染色、Annexin V-FITC/PI雙染檢測細(xì)胞凋亡,確定蓖麻毒蛋白誘導(dǎo)HuTu-80細(xì)胞早期凋亡時相,提取細(xì)胞組分蛋白進(jìn)行Western-blot分析,觀察HuTu-80細(xì)胞在凋亡過程中細(xì)胞色素c的遷移情況。結(jié)果表明：蓖麻毒蛋白對HuTu-80細(xì)胞的增殖和生長有明顯的抑制作用,IC50為200ng/ml,攻毒時間為8h,同時HuTu-80細(xì)胞的形態(tài)特征與生物化學(xué)特征也發(fā)生了一系列的變化,細(xì)胞核出現(xiàn)皺縮和破裂的情況,釋放出致密顆粒狀凋亡小體,細(xì)胞膜上的磷脂酰絲氨酸出現(xiàn)外翻,而細(xì)胞色素c隨著蓖麻毒蛋白處理時間的增加,從線粒體易位到細(xì)胞漿逐漸顯著。

3.用蓖麻毒蛋白濃度為200ng/ml,時間為8h處理細(xì)胞,分別提取正常組和處理組的HuTu-80細(xì)胞全蛋白,iTRAQ同位素標(biāo)記技術(shù)與質(zhì)譜檢測技術(shù)得到1660個蛋白信息,其中采用假設(shè)檢驗(yàn)的方法對蛋白質(zhì)定量結(jié)果進(jìn)行差異分析,選取p-value<0.05的蛋白質(zhì)作為差異蛋白質(zhì),共的到94個差異蛋白質(zhì),這為以后研究蓖麻毒蛋白誘導(dǎo)HuTu-80細(xì)胞凋亡機(jī)制提供了參考依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

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[2]Waltonitone induces human hepatocellular carcinoma cells apoptosis in vitro and in vivo[J].Zhang Zhang,Shuo Wang,Hong Qiu,Chaohui Duan,Kan Ding,Zhengtao Wang.Cancer Letters.2009(2)

[3]Taurine protects transformed rat retinal ganglion cells from hypoxia-induced apoptosis by preventing mitochondrial dysfunction[J].Ka Chen,Qianyong Zhang,Jian Wang,Fengjin Liu,Mantian Mi,Hongxia Xu,Fang Chen,Kaihong Zeng.Brain Research.2009

[4]Quantitative Proteomic Analysis of Mitochondria in Aging PS-1 Transgenic Mice[J].You-Jun Fu,Shuling Xiong,Mark A.Lovell,Bert C.Lynn.Cellular and Molecular Neurobiology.2009(5)

[5]欒世慧.蓖麻毒蛋白誘導(dǎo)HuTu-80細(xì)胞凋亡的比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究[D].內(nèi)蒙古民族大學(xué),2012.