背景[1-3]
GES-1人胃粘膜上皮細(xì)胞是人胃粘膜上皮成熟細(xì)胞系主要用于胃上皮細(xì)胞提供重要的模式系統(tǒng)。原代培養(yǎng)的胎兒正常胃粘膜上皮細(xì)胞用SV40病毒感染,3周左右分離出了轉(zhuǎn)化細(xì)胞克隆,并建立了可在體外長期穩(wěn)定傳代的細(xì)胞系GES-1。
對此細(xì)胞的生物學(xué)特性分析表明:細(xì)胞的基因組中整合了SV40T基因,并在細(xì)胞核中表達(dá)。染色體為近三倍體(50~60之間)。除了轉(zhuǎn)化特性之外,GES-1細(xì)胞基本保留了正常的細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)(微絲、微管、角蛋白),粘蛋白反應(yīng)陽性。接種在裸鼠中6個月觀察無致瘤性。
GES-1人胃粘膜上皮細(xì)胞
細(xì)胞培養(yǎng)操作
培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：
準(zhǔn)備DMEM培養(yǎng)基(DMEM，GIBCO，)，90%；胎牛血清，10%。培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。液氮儲存。
細(xì)胞處理：
復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準(zhǔn)備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液移入含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。
細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。
加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加入3ml此細(xì)胞的培養(yǎng)基終止消化。
輕輕吹打后吸出，移入15ml離心管中，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)液后吹勻。移入到事先準(zhǔn)備好的含有5ml培養(yǎng)基的T-25培養(yǎng)瓶中或含有14ml培養(yǎng)基的T-75培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。
細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。貼壁細(xì)胞凍存時，先要消化處理并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。消化方法按照細(xì)胞傳代方法的1-3步驟進(jìn)行，最后的重懸液使用血清。懸浮細(xì)胞直接計(jì)數(shù)后離心，用血清重懸浮，加DMSO至最終濃度為10%。加入DMSO后迅速混勻，按每1ml的數(shù)量分配到凍存管中。本公司按每個凍存管細(xì)胞數(shù)目大于1X106個細(xì)胞凍存。
應(yīng)用[4][5]
用于RTN4高表達(dá)對永生化胃粘膜上皮GES1細(xì)胞增殖的影響及機(jī)制研究
為闡明其發(fā)生發(fā)展機(jī)制,課題組前期篩選出胃癌組織高表達(dá)差異蛋白質(zhì)RTN4,進(jìn)一步了解其在胃癌發(fā)病過程中的作用與機(jī)制,可為揭示胃癌發(fā)病的分子機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)資料。
方法:1、采用PCR方法構(gòu)建p IRESneo3-RTN4真核表達(dá)載體,利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將p IRESneo3-RTN4真核表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染永生化胃粘膜上皮GES1細(xì)胞,500mg/L G418篩選2周后匯合克隆,擴(kuò)大培養(yǎng),建立RTN4高表達(dá)GES1細(xì)胞系,即GES1-RTN4（GES1-p IRESneo3為載體對照）細(xì)胞;
2、通過細(xì)胞免疫熒光和Western-blot檢測GES1-RTN4（GES1-p IRESneo3為載體對照）細(xì)胞中RTN4的表達(dá);
3、運(yùn)用細(xì)胞生長曲線、平皿克隆與軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞儀等,觀察RTN4高表達(dá)對GES1細(xì)胞生長與增殖、周期與凋亡的影響。
4、采用Western-blot檢測GES1-RTN4（GES1-p IRESneo3為載體對照）細(xì)胞中IκBα蛋白的表達(dá)。
結(jié)果:1、細(xì)胞生長曲線結(jié)果顯示:GES1-RTN4細(xì)胞的生長速度較GES1和GES1-p IRESneo3細(xì)胞明顯加快,說明RTN4高表達(dá)后促進(jìn)GES1細(xì)胞的生長與增殖（P<0.01）;
2、平皿克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:GES1、GES1-p IRESneo3和GES1-RTN4細(xì)胞的克隆數(shù)分別為56±8、65±12和128±21（個）,GES1-RTN4細(xì)胞形成克隆數(shù)目較GES1和GES1-p IRESneo3細(xì)胞明顯增多（P<0.01）,且克隆體積大,說明RTN4高表達(dá)后,GES1細(xì)胞的克隆形成能力明顯增加;
3、軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:GES1、GES1-p IRESneo3和GES1-RTN4細(xì)胞的集落數(shù)分別為64±12、72±16和146±28（個）,GES1-RTN4細(xì)胞形成的集落較GES1和GES1-p IRESneo3細(xì)胞明顯增多（P<0.01）,且集落體積大,說明RTN4高表達(dá)后GES1細(xì)胞的集落形成能力明顯增加;
4、流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示:GES1細(xì)胞S期細(xì)胞比為45.63±4.62,G1期細(xì)胞比為49.57±8.49,細(xì)胞增殖指數(shù)為50.43;GES1-p IRESneo3細(xì)胞S期細(xì)胞比為30.10±6.28,G1期細(xì)胞比為48.75±7.86,細(xì)胞增殖指數(shù)為51.25;GES1-RTN4細(xì)胞S期細(xì)胞比為55.28±9.15,G1期細(xì)胞比為26.88±3.42,細(xì)胞的增殖指數(shù)為73.13。
說明RTN4高表達(dá)后GES1細(xì)胞中S期細(xì)胞比例明顯增加,G1細(xì)胞比例降低,細(xì)胞增殖指數(shù)增加（P<0.01）;同時,GES1、GES1-p IRESneo3和GES1-RTN4細(xì)胞的凋亡率降分別為24.65±4.58、24.43±3.36和17.52±1.23,說明RTN4高表達(dá)后,細(xì)胞的凋亡率降低（P<0.01）。
5、Western-blot結(jié)果顯示:GES1-RTN4細(xì)胞中IκBα蛋白表達(dá)較GES1和GES1-p IRESneo3細(xì)胞減少（P<0.01）。
參考文獻(xiàn)
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