背景及概述
果糖-1，6-二磷酸（FDP）鈉鹽系細(xì)胞分子水平藥物，它具有改善細(xì)胞代謝，增加能量利用，加速組織修復(fù)，恢復(fù)正常功能，保護(hù)紅細(xì)胞韌性，以及維持紅細(xì)胞釋氧能力等功效。適應(yīng)癥有：休克、心肌缺血及急性心肌梗塞，缺血性腦血管意外、麻醉意外、外周血管疾患、糖尿病血管病變、子宮內(nèi)膜病變、外科復(fù)合傷及燒傷、體外循環(huán)及多次輸血中的輔助治療，以及外科胃腸外營(yíng)養(yǎng)療法等，因此具有廣泛的臨床藥用前景。果糖二磷酸鈉性狀圖如下：
圖1 果糖二磷酸鈉性狀圖
制備
以蔗糖、磷酸鹽為原料加入新鮮酵母或干酵母發(fā)酵制備CaFDP、BaFDP，再?gòu)腃aFDP或BaFDP經(jīng)馬錢(qián)子堿純化得到FDP。華東理工大學(xué)、常州生化藥廠以蔗糖為原料加啤酒酵母發(fā)酵制備N(xiāo)aFDP。我們用商品面包酵母發(fā)酵法生產(chǎn)藥用FDP，原料以市售面包酵母和淀粉為主，方法簡(jiǎn)易、成本低廉，產(chǎn)率為10.5％。本工作為我國(guó)進(jìn)行藥用FDP的商業(yè)化生產(chǎn)打下了基礎(chǔ)[1]。
粗FDP的制備
稱(chēng)取2kg淀粉，咖入適量的磷酸鹽及20kg水配成溶液，再加入干酵母，把混合物攪勻，至恒溫水浴發(fā)酵，4h后，加入10％辛醇-酒精溶劑以終止發(fā)酵，隨即在沸水浴加熱10min，使蛋白質(zhì)凝固沉淀，離心15min，收集上清液，粗FDP游離存在于上清液中。
制備FDP鋇鹽
發(fā)酵液離心后得到的上清液加入鋇鹽溶液，出現(xiàn)白色沉淀，抽濾，用熱水洗滌2次，得BaFDP粗品750g。
制備FDP鈣鹽
方法與2.1.2類(lèi)似，用無(wú)水CaCl2代替鋇鹽得CaFDP粗品224g。
FDP鋇鹽到鈉鹽的轉(zhuǎn)化
750gBaFDP懸浮液加入鈉鹽溶液，攪拌，過(guò)濾除去BaSO4沉淀，加入乙醇后置冰箱1.5h，抽濾，得白色NaFDP粗品，反復(fù)用無(wú)水乙醇沉淀，以去掉鹽份，重結(jié)晶數(shù)次，最后得NaFDP精制品，自然干燥后稱(chēng)重得210g。
FDP鈣鹽到鈉鹽的轉(zhuǎn)化
112gFDP鈣鹽懸浮液，加入鈉鹽，振搖，抽濾得濾液150ml，加入酒精沉淀，冰箱放置1.5h，抽濾，得NaFDP粗品，反復(fù)溶解后用無(wú)水乙醇沉淀，去掉鹽分，得產(chǎn)品NaFDP41.5g。
分析
HF254熒光薄層層析
取5×15cm的玻璃板一塊，取1g硅膠HF254，放在研缽中加入適量的羧甲纖維素鈉溶液，加入4－5滴95％乙醇（消泡用）研磨數(shù)分鐘，研好的勻漿倒在玻璃板上，使其分布均勻，自然干燥后置105℃烘箱中活化30min。然后點(diǎn)樣并展層，所用展開(kāi)劑為乙酸乙酯∶甲醇∶乙酸∶水＝12∶3∶3∶2在層析缸中采用傾斜上行法展層，展開(kāi)劑距離薄層板上端2cm時(shí)取出，放于40℃烘箱中烘干，在紫外燈下熒光顯示。
比旋度的測(cè)定
分別配制濃度為10mg／ml的產(chǎn)品溶液和標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液，用全自動(dòng)旋光儀測(cè)定旋光度，計(jì)算比旋光度，產(chǎn)品和標(biāo)準(zhǔn)樣品各測(cè)三次，取平均值。
產(chǎn)品純度測(cè)定采用酶法測(cè)定。取一定量的FDP標(biāo)準(zhǔn)液加兔肌醛縮酶和α-磷酸甘油醛脫氫酶，NADH，在340nm處測(cè)定光吸收的減少，作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。另取一定量的產(chǎn)品按上述方法測(cè)定，在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上查出產(chǎn)品中FDP的實(shí)際含量。
1, 6-二磷酸果糖鈉鹽結(jié)晶新工藝研究
(1)酒精-醋酸鈉體系結(jié)晶FDP與酒精-低溫體系結(jié)晶FDP相比，由于降低了溶液的粘度及過(guò)飽和度，改善了溶液的傳質(zhì)狀況，通過(guò)控制成核速率和晶體的生長(zhǎng)速率，從而控制晶體的大小，提高晶體顆粒的均一性。另外由于同離子效應(yīng)的作用，醋酸鈉的加入，增加了溶液的化學(xué)勢(shì)，縮短了誘導(dǎo)期的時(shí)間。
(2)pH值和溫度對(duì)晶體粒度分布的影響較大。如溶液的pH值從4.5增加到5.2相差0.7，而晶體的平均粒度差異卻達(dá)84μm，又如結(jié)晶溫度從20℃增加到30℃，而晶體顆粒卻從92μm增加到241μm，因此可以通過(guò)控制溶液的pH值和結(jié)晶溫度控制晶體顆粒大小。
總之利用本工藝結(jié)晶FDP不但可以縮短結(jié)晶時(shí)間，提高產(chǎn)品收率，而且可以控制產(chǎn)品的均一性和顆粒大小，從而提高產(chǎn)品的質(zhì)量和穩(wěn)定性。關(guān)于1，6-二磷酸果糖鈉鹽結(jié)晶時(shí)的相變、成核機(jī)理和結(jié)晶動(dòng)力學(xué)還有待進(jìn)一步的研究。
討論
本文介紹了從游離的FDP制備N(xiāo)aFDP的兩條途徑：
（1）從游離的FDP合成CaFDP，再由它轉(zhuǎn)化成NaFDP；
（2）從游離的FDP中和成BaFDP，再由它轉(zhuǎn)化成NaFDP。
在條途徑中，CaFDP的顆粒較大，沉淀疏松，易吸附大量水分和鹽，使轉(zhuǎn)化效率低，雜質(zhì)帶入多，而導(dǎo)致通過(guò)條途徑所得的NaFDP的量很少，產(chǎn)率低，不適于生產(chǎn)應(yīng)用。而B(niǎo)aFDP的顆粒細(xì)，沉淀緊密，可以通過(guò)抽濾，洗去大量鹽類(lèi)和雜質(zhì)，且BaSO4沉淀完全，使之有較高的轉(zhuǎn)化效率，雜質(zhì)少，易純化，產(chǎn)品得率10.5％。薄層層析、比旋光度測(cè)定是定性的依據(jù)，兔肌醛縮酶只專(zhuān)一性地作用于FDP，所以是定量分析，NMR是化學(xué)結(jié)構(gòu)分析，從1HNMR顯示，樣品與標(biāo)準(zhǔn)品波譜相同。又從13CNMR顯示其樣品與標(biāo)準(zhǔn)品波譜相同，因13C波譜與C骨架直接相連的原子化學(xué)環(huán)境有關(guān)，超過(guò)二鍵以上的基團(tuán)影響C線(xiàn)的化學(xué)位移在圖上沒(méi)有影響，所以樣品與標(biāo)準(zhǔn)品主結(jié)構(gòu)完全一致。以上分析證實(shí)確系果糖-1，6-二磷酸，HPLC分析既是定性又是定量分析，根據(jù)提供的測(cè)試結(jié)果。
本文用高壓液相色譜（HPLC）、核磁共振氫譜（1HNMR）、核磁共振碳譜（13CNMR）來(lái)檢測(cè)FDP結(jié)構(gòu)，這在國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)報(bào)導(dǎo)。因此，我們?yōu)镕DP結(jié)構(gòu)的檢測(cè)提供了一系列新的方法。本工藝簡(jiǎn)單，產(chǎn)品得率高，質(zhì)量好，且原料價(jià)格低廉，取材方便，經(jīng)濟(jì)效益顯著。
參考文獻(xiàn)
[1] 應(yīng)漢杰. 1, 6-二磷酸果糖制備新技術(shù)的研究 [博士論文].南京化工大學(xué) , 1998