背景[1-3]
人膽囊癌細胞是從一位61歲的男性低分化膽囊癌患者中建立的；GBC-SD細胞的形狀有多邊形、紡錘形和正方形；GBC-SD細胞能分泌CEA和CA19-9。GBC-SD細胞倍增時間大約為21.4小時，可移植到裸鼠，生成的腫瘤與原發(fā)腫瘤相似。
人膽囊癌細胞
細胞培養(yǎng)步驟
一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準備：
1）準備DMEM培養(yǎng)基；優(yōu)質胎牛血清，10%；雙抗，1%。
2）培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。
3）凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。
二．細胞處理：
1）復蘇細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，離心管加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在800-1000RPM條件下離心4-5分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入T25培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，補加培養(yǎng)基至6ml。
2）細胞傳代：如果細胞密度達80%，即可進行傳代培養(yǎng)。
1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。
2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加入3-4ml此細胞的培養(yǎng)基終止消化。
3.輕輕吹打后吸出，移入15ml離心管中，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)液后吹勻。
4.收到細胞后首次傳代推薦將細胞懸液按1：2的比例分到新的含6ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，建議凍存一支備用，后續(xù)傳代根據(jù)實際情況按1:2到1:4的比例進行。
3）細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時，可進行細胞凍存。
應用[4][5]
用于青蒿琥酯聯(lián)合5-氟尿嘧啶對人膽囊癌細胞作用的實驗研究
研究青蒿琥酯和5-FU對人膽囊癌細胞的增殖、遷移、凋亡和細胞周期的影響,比較兩種藥物對細胞的作用強度,探究青蒿琥酯在治療膽囊癌中的應用前景。
方法：用CCK-8法來檢測青蒿琥酯和5-FU的OD值并計算半數(shù)抑制濃度（IC50）值;使用EdU-488法和克隆形成實驗用來測定青蒿琥酯和5-FU對細胞增殖的影響;細胞劃痕實驗用來測定青蒿琥酯和5-FU單用和聯(lián)用對細胞遷移的影響;使用Annexin V和PI雙標法標記細胞,使用流式細胞儀用來測定青蒿琥酯和5-FU單用和聯(lián)用誘導細胞凋亡發(fā)生的情況;使用PI單標法標記細胞,使用流式細胞儀來測定青蒿琥酯和5-FU單用和聯(lián)用對細胞周期的影響情況。
結果：CCK-8法顯示選取48h的OD值數(shù)據(jù)計算得出的結果作為青蒿琥酯的IC50值,IC50=43.7μmol/L,5-FU的IC50=28.1μmol/L。在24h和48h觀察時間點內,與對照組相比,5-FU組和青蒿琥酯組對細胞的增殖能力有抑制作用。EdU-488法顯示與對照組相比,5-FU組和青蒿琥酯組以及兩藥聯(lián)合作用組對細胞的增殖有抑制作用。細胞劃痕的結果顯示與對照組相比,5-FU組和青蒿琥酯組以及兩藥聯(lián)合組對細胞的遷移能力有抑制作用。
Annexin V和PI雙標法檢測5-FU組和青蒿琥酯組以及兩藥聯(lián)合組誘導細胞凋亡的能力顯示與對照組相比,5-FU組和青蒿琥酯組以及兩藥聯(lián)合組對細胞的凋亡發(fā)生有明顯促進作用。PI單標法用來檢測細胞的細胞周期,5-FU組、青蒿琥酯組以及在兩藥聯(lián)合作用組時顯示與對照組相比,5-FU組、青蒿琥酯組以及兩藥聯(lián)合組能抑制細胞的S期和G2/M期。
結論：1.青蒿琥酯在體外可抑制GBC-SD膽囊癌細胞的增殖、凋亡;2.在體外實驗中,青蒿琥酯和5-FU聯(lián)用較青蒿琥酯單用抗腫瘤的效果更好;3.在體外實驗中,青蒿琥酯和5-FU聯(lián)用較5-FU單用抗腫瘤的效果更好;4.在體外實驗中,青蒿琥酯抗腫瘤的效果弱于5-FU抗腫瘤的效果。
參考文獻
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[3]Artemisinins as a novel anti-cancer therapy:Targeting a global cancer pandemic through drug repurposing[J].Augustin Yolanda,Staines Henry,Krishna Sanjeev.Pharmacology&Therapeutics.2020(prep)
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[5]洪茂林.青蒿琥酯聯(lián)合5-氟尿嘧啶對人膽囊癌細胞作用的實驗研究[D].昆明醫(yī)科大學,2021.