背景及概述[1][2]
孔雀石綠（MG），化學(xué)名稱為四甲基代二氨基三苯甲烷，別名堿性孔雀石綠、堿性綠、鹽基塊綠、苯胺綠等，為翠綠色有光澤的結(jié)晶，屬三苯甲烷類染料?？兹妇G是一種有機(jī)染料，易溶于水，水溶液呈藍(lán)綠色，工業(yè)應(yīng)用廣泛。孔雀綠能對水體中的魚、蝦產(chǎn)生毒性，可通過食物鏈對哺乳動(dòng)物以及人類產(chǎn)生致畸、致癌、致突變等作用，并對腫瘤生長起到促進(jìn)作用，因而這種物質(zhì)在陸地和水生生態(tài)系統(tǒng)中的生物積累對環(huán)境和人類健康都有影響。因此，對孔雀綠廢水進(jìn)行處理已成為當(dāng)務(wù)之急。
目前研究的降解孔雀綠的方法主要包括微生物法、吸附法、微波法、光催化法和芬頓試劑法等等，其中以微生物法和光催化降解研究最多。生物降解主要是通過微生物的相關(guān)酶系對染料分子進(jìn)行氧化或還原，破壞其發(fā)色基團(tuán)或不飽和鍵，使染料分子最終降解為無機(jī)物或成為微生物自身需要的營養(yǎng)物，主要降解途徑是：孔雀綠經(jīng)過羥基化后，降解生成米氏酮和苯酚；此外，孔雀綠還可以通過逐步的脫甲基反應(yīng)，降解生成二甲氨基二苯甲酮和對氨基苯酚，二甲氨基二苯甲酮可以通過加羥基或逐步的脫甲基反應(yīng)進(jìn)一步降解。
光催化法降解孔雀綠可能的途徑是孔雀綠的中心碳原子和羥基自由基作用，中心碳原子的C-C鍵斷裂生成4-羥基二乙氨基苯胺和4-二甲氨基苯甲酮，這些碎片分子進(jìn)一步開環(huán)氧化為對羥基苯甲酸和苯甲酸等，這些帶苯環(huán)的酸性物質(zhì)再進(jìn)一步氧化為草酸，丁烯二酸，甲酸等小分子的酸。這些方法在降解過程中容易產(chǎn)生有毒的酚類、苯胺和酮類物質(zhì)，降解過程復(fù)雜，反應(yīng)條件難于控制，與此同時(shí)，反應(yīng)時(shí)間較長（如光催化降解孔雀綠為小分子化合物需要40小時(shí)），耗費(fèi)較大的能量。
理化性質(zhì)
孔雀石綠易溶于水和乙醇。它是由一分子苯甲醛和兩分子 N，N-二甲基苯胺在鹽酸或硫酸中縮合生成四甲基代二氨基三苯甲烷的隱性堿體后，在酸性介質(zhì)中被二氧化鉛氧化制得的深綠色晶體，因其外觀色呈孔雀綠而得名?？兹甘G多以草酸鹽形式制備并在市面上出售，鹽酸鹽( malachite green chloride/C23H25 N 2 +Cl-)比較少見。孔雀石綠鹽酸鹽是 1種工業(yè)級化學(xué)物質(zhì)，是在孔雀石綠生產(chǎn)過程中加氯化鋅而合成的 1 種雙鋅鹽。在水溶液中，孔雀石綠陽離子(有色形式) 和活性氫氧根離子結(jié)合，生成非離子化的無色醇堿，其具有較高的親脂性，因而認(rèn)為孔雀石綠入侵細(xì)胞可能是以醇堿的形式。
代謝[2]
孔雀石綠進(jìn)入動(dòng)物機(jī)體后，通過生物轉(zhuǎn)化，還原成脂溶性的無色孔雀石綠，并在組織中蓄積，因此在魚體組織中檢測到的殘留物主要是無色孔雀石綠，其在機(jī)體內(nèi)的分布和代謝速率主要取決于脂肪的含量。用高效液相色譜/大氣壓化學(xué)電離質(zhì)譜分析方法( HPLC/APCI/M S)在肝組織提取液中檢出無色孔雀石綠在甲狀腺過氧化物酶( TPO) 氧化催化下脫甲基生成的初級和次級代謝產(chǎn)物芳香胺。
這些代謝產(chǎn)物與具有致癌作用的芳香胺的結(jié)構(gòu)類似，可直接或酯化后與DNA 發(fā)生反應(yīng)，通過對肝臟 DNA 進(jìn)行32 P -后標(biāo)記可證明 DNA 加合物的結(jié)構(gòu)，這次驗(yàn)證了其潛在的結(jié)構(gòu)致癌性。從圖中可以看出孔雀石綠在機(jī)體內(nèi)具有 2 種代謝途徑：一是孔雀石綠在還原酶的催化下降解成無色孔雀石綠；二是在細(xì)胞色素 P-450 催化下經(jīng) N —脫甲基作用生成初級和次級代謝產(chǎn)物芳香胺。無色孔雀石綠的代謝途徑如下：一是在氧化酶的作用下被重新氧化成孔雀石綠；二是在 TPO 催化下脫甲基生成初級和次級代謝產(chǎn)物芳香胺，芳香胺再進(jìn)一步酯化后與DNA反應(yīng)生成 DNA 加合物。
毒性[2]
1. 孔雀石綠對水生動(dòng)物的毒副作用
相關(guān)研究表明孔雀石綠的毒性較強(qiáng)，對水生動(dòng)物的安全濃度較低。如對翹嘴紅、虹鱒魚苗、加州鱸魚和對蝦蝦苗的安全濃度分別為 0.031，0.025，0.02 和
0.01 mg/ L，這比孔雀石綠的有效用藥濃度 0.10 ～0.20 mg/L低，因此孔雀石綠在上述水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物中使用是不安全的。研究發(fā)現(xiàn)，隨著暴露時(shí)間、溫度和濃度的增加，孔雀石綠和無色孔雀石綠對魚類的毒性增強(qiáng)，另外毒性也與環(huán)境因素，特別是 pH 值、硬度和溶解氧的多少有關(guān)。近來國外學(xué)者關(guān)于孔雀石綠和無色孔雀石綠對虹鱒、鲇魚等魚類各器官的毒性、藥物代謝動(dòng)力學(xué)、組織病理學(xué)進(jìn)行了研究。
2. 孔雀石綠對哺乳動(dòng)物的毒性
1）致癌性：孔雀石綠的官能團(tuán)三苯甲烷分子中與苯環(huán)相連的亞甲基和次甲基受苯環(huán)影響有較高的反應(yīng)活性，可生成三苯甲基，同時(shí)孔雀石綠能抑制人體谷
胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶的活性，嵌入 DNA 生成加合物。這 2種情況均能造成人體器官組織氧壓的改變和脂質(zhì)過氧化，使細(xì)胞凋亡，進(jìn)而誘發(fā)腫瘤，而來源于上皮組織的惡性腫瘤即為“癌”。
孔雀石綠代謝產(chǎn)物的衍生物及初級和次級芳香胺在癌癥發(fā)生中起著重要的作用。如小分子芳香胺，尤其是 1～4 個(gè)芳香環(huán)結(jié)構(gòu)進(jìn)入人體后，會(huì)穿過細(xì)胞膜，到達(dá)細(xì)胞核中的 DNA。芳香胺易產(chǎn)生活潑的親電子“陽氮離子”，攻擊 DNA 上的親核位置，相互以共價(jià)鍵結(jié)合，或者芳香胺分子的扁平部分“插入”正常細(xì)胞中 DNA 螺旋線結(jié)構(gòu)的相鄰堿基對之間，從而破壞DNA 導(dǎo)致癌變。
2）遺傳毒性：研究發(fā)現(xiàn)孔雀石綠和無色孔雀石綠的致基因突變試驗(yàn)結(jié)果均為陽性?？兹甘G可誘發(fā)敘利亞倉鼠胚胎細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制與改變腫瘤抑制基因p53 和 bcl-2 家族蛋白基因的表達(dá)有關(guān)。
孔雀石綠草酸鹽在 S9 作用下可致鼠傷寒沙門菌 T98 基因突變，盡管體內(nèi)微核實(shí)驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)致染色體損傷作用，但給予F344 大鼠和 B6C3F1 小鼠 9，100 mg/kg 和 600 mg/kg的孔雀石綠或 96 mg/kg 和 580 mg/kg 的無色孔雀石綠 28 d，用32P 后標(biāo)記法在肝臟中檢出 DNA 加合物，并且隨著孔雀石綠和無色孔雀石綠濃度的增加，DNA 加合物的量也增加。外周血淋巴細(xì)胞微核試驗(yàn)和轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟中凝血抑制因子( lacI) 突變試驗(yàn)結(jié)果呈陰性。
3）慢性毒性：通過動(dòng)物試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)孔雀石綠可引起肝、腎、心臟、脾、皮膚、眼睛、肺等多器官毒性。在孔雀石綠和無色孔雀石綠的毒性和體內(nèi)代謝試驗(yàn)中，給予 F344 雌性大鼠和 B6C3F1 小鼠 1 200mg/kg 的孔雀石綠或 1 160 mg/kg 無色孔雀石綠 28 d，測得 F344 雌性大鼠 r-谷胺酰轉(zhuǎn)肽酶水平與對照組相比有明顯的線性增長趨勢，并誘發(fā)小鼠膀胱上皮細(xì)胞和甲狀腺濾泡細(xì)胞大量凋亡，肝細(xì)胞空泡化。
同時(shí)，無色孔雀石綠可誘裂 Hamster 鼠肝細(xì)胞，導(dǎo)致甲狀腺上皮細(xì)胞液泡化，減少甲狀腺激素的合成與釋放，降低四碘甲狀腺原氨酸( T4)水平，增加甲狀腺刺激激素(TSH) 水平。對血液學(xué)參數(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，紅細(xì)胞總數(shù)、血紅蛋白數(shù)量、血細(xì)胞比容、平均紅細(xì)胞濃度顯著下降。B6C3F1 小鼠血液中紅細(xì)胞容積和網(wǎng)狀細(xì)胞數(shù)量都增加。此外孔雀石綠能抑制血漿膽堿脂酶的活性，進(jìn)而
造成乙酰膽堿的蓄積而出現(xiàn)神經(jīng)癥狀。
應(yīng)用[3]
孔雀綠常被用于制陶業(yè)、紡織業(yè)、皮革業(yè)、食品顏色劑和細(xì)胞化學(xué)染色劑，因其能有效預(yù)防水產(chǎn)品真菌感染和殺死寄生蟲，1933年起作為驅(qū)蟲劑、殺蟲劑、防腐劑在水產(chǎn)中使用，后曾被廣泛用于預(yù)防與治療各類水產(chǎn)動(dòng)物的水霉病、鰓霉病和小瓜蟲病等。從上世紀(jì)90年代開始，國內(nèi)外學(xué)者陸續(xù)發(fā)現(xiàn)孔雀綠能引起魚類的鰓和皮膚上皮細(xì)胞輕度炎癥；使腎管腔有輕度擴(kuò)張，腎小管壁細(xì)胞的胞核也擴(kuò)大；具有致突變、致畸、致癌等危害。
檢測方法[3]
目前，MG 的檢測方法主要有高效液相色譜法-紫外檢測法，高效液相色譜-安培法、高效液相色譜法-質(zhì)譜聯(lián)用法、酶聯(lián)免疫法毛細(xì)管電泳法等。高效液相色譜法紫外 檢測，MG 的響應(yīng)相對較低；利用MG能被硼氫化鉀還原為隱色孔雀石綠(LMG)，LMG 具有熒光 響應(yīng)的特點(diǎn)，采用高效液相色譜法-熒光檢測法進(jìn)行分析檢測，有助于提高M(jìn)G殘留檢測的 靈敏度。
有研究提供一種分離分析大體積環(huán)境水樣中微量孔雀綠的方法。具體步驟為：
1)采用高內(nèi)相乳液聚合技術(shù)合成具有親水性的聚苯乙烯STY-二乙烯苯DVB-甲基丙烯 酸縮水甘油酯GMA高內(nèi)相乳液聚合整體柱，即STY/DVB/GMA polyHIPE整體柱。
2)在300mL環(huán)境水樣品中加入3mL甲酸使環(huán)境水樣品呈酸性，再加入3mL濃度為 0.04mol/L 的硼氫化鉀還原孔雀綠，所得混合液在蠕動(dòng)泵或高壓泵的作用下以2mL/min的 流速通過步驟(1)制得的STY/DVB/GMA polyHIPE整體柱，萃取并富集環(huán)境水樣品中存在的 痕量還原型孔雀綠（L MG）。
3)采用體積比為1：4的PBS/乙腈混合溶液清洗STY/DVB/GMA polyHIPE整體柱，除 去吸附力小的干擾物質(zhì)，再用體積比為1：1的乙醇/三氯甲烷混合溶液洗脫富集在STY/DVB/ GMA polyHIPE整體柱上的孔雀綠目標(biāo)物，收集洗脫液放入進(jìn)樣瓶，用高效液相色譜-熒光光 譜聯(lián)用分析測定，即實(shí)現(xiàn)對大體積環(huán)境水樣中微量孔雀綠的分離分析。
本方法采用高內(nèi)相乳液（HIPE）法，制備了新型STY/DVB/GMA polyHIPE整體柱，整體柱比表面積大，孔徑較小，孔間通道數(shù)目多，形成巨大相互貫通的蜂窩結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明方 法操作簡單、重復(fù)性好、靈敏度高，檢測結(jié)果可靠，可應(yīng)用于各種環(huán)境水樣品中痕量MG的準(zhǔn) 確檢測。經(jīng)過對單體比例的調(diào)控、相比的優(yōu)化，使得乳液穩(wěn)定性增加，乳液不斷變粘稠，獲得了吸附性強(qiáng)、流通性好、穩(wěn)定性與重現(xiàn)性好的高內(nèi)相乳液聚合物整體柱；對孔雀綠或還 原型孔雀綠具有高的萃取和富集能力，可應(yīng)用于復(fù)雜水體樣品中痕量孔雀綠的選擇性萃取、富集和分析；采用硼氫化鉀還原樣品中孔雀綠，使其能采用高效液相色譜-熒光光譜儀（HPLC-FLD）方法進(jìn)行定性定量分析，實(shí)現(xiàn)了大體積環(huán)境水樣中孔雀綠的高靈敏、超微量準(zhǔn)確分析。
主要參考資料
[1] CN201510223264.8 一種降解孔雀綠廢水的方法
[2] 翟毓秀, 郭瑩瑩, 耿霞, 等. 孔雀石綠的代謝機(jī)理及生物毒性研究進(jìn)展[J]. 中國海洋大學(xué)學(xué)報(bào) (自然科學(xué)版), 2007, 37(1): 27-32.
[3] CN201710512070.9 一種分離分析大體積環(huán)境水樣中微量孔雀綠的方法