背景[1-3]
糞便基因組DNA快速提取試劑盒適用于從糞便樣本中提取總DNA，包括細(xì)胞、細(xì)菌、寄生蟲(chóng)以及病毒DNA，也適用于含有高濃度PCR反應(yīng)抑制劑的樣本。本品可處理多至300 mg的糞便樣本，純化獲得主要為20-30 kb的DNA片段，純化過(guò)程中不需苯酚或氯仿等有毒溶劑，無(wú)需乙醇沉淀，可在一小時(shí)內(nèi)獲得高純度的DNA。
本試劑盒采用獨(dú)特的緩沖系統(tǒng)使裂解液中的DNA高效結(jié)合到吸附柱上，同時(shí)糞便中的蛋白雜質(zhì)及抑制下游反應(yīng)的其他有機(jī)化合物可流過(guò)膜，PCR和酶反應(yīng)的抑制劑以及殘留的雜質(zhì)可通過(guò)兩步洗滌步驟有效去除，最后使用低鹽緩沖液或水洗脫，即可獲得高純度DNA。純化得到的DNA可以直接用于酶切、PCR、Real-Time PCR、文庫(kù)構(gòu)建、Southern Blot、分子標(biāo)記等下游實(shí)驗(yàn)。
糞便基因組DNA快速提取試劑盒
操作步驟：
1.準(zhǔn)備工作:取TE buffer,加至蛋白酶K中,充分混勻,配制成20mg/ml的白酶K溶液,可分裝成小份,20保存1年有效。
2.取菌液置于EP管中,離心,棄上清液。再次加入1.5m菌液,重復(fù)該步驟一次。
3.加入Eco裂解液和3μl白酶K溶液(20mg/ml),充分混勻,37℃孵育1h。
4.加入CTAB沉淀液,充分混勻,65℃孵育10min
5.加入780蛋白清除液,充分混勻,12000g離心5~10min
6.轉(zhuǎn)移上清至新EP管中,加入2倍體積的Eco漂洗液,混勻,20℃放置30min或過(guò)夜。
7.13000g離心10min,棄上清液,加入70%乙醇洗滌沉淀
8.13000g離心10min,棄上清液,室溫干燥DNA沉淀,加入100或適量TE buffer溶解沉淀,20℃保存。TE buffer體積越大,DNA濃度越低。
應(yīng)用[4][5]
用于基于LFD-RPA的主要腸道血吸蟲(chóng)核酸快速可視化檢測(cè)方法的建立及初步評(píng)價(jià)研究
結(jié)合側(cè)流層析試紙條（Lateral flow dipstick,LFD）和重組酶聚合酶擴(kuò)增（Recombinase polymerase amplification,RPA）方法,建立能簡(jiǎn)單、快速識(shí)別日本血吸蟲(chóng)、曼氏血吸蟲(chóng)核酸的可視化檢測(cè)技術(shù),初步評(píng)價(jià)其對(duì)血吸蟲(chóng)中間宿主或終宿主感染早期的檢測(cè)價(jià)值,并通過(guò)試劑、時(shí)間的折算,分析成本投入情況。
方法:以日本血吸蟲(chóng)SjR2和SjG55A作為靶基因,結(jié)合Primer Premier 5軟件及手工輔助設(shè)計(jì)引物,通過(guò)簡(jiǎn)易檢出限、特異性確定引物序列,初步建立RPA檢測(cè)方法。以RPA檢測(cè)為基礎(chǔ),設(shè)計(jì)探針,確定反應(yīng)條件,初步建立LFD-RPA檢測(cè)方法。以PCR方法為平行對(duì)照,評(píng)價(jià)建立檢測(cè)方法的最低檢出限、敏感性、特異性及不同終止方式檢測(cè)結(jié)果。
制備不同比例混合的陽(yáng)性釘螺和陰性釘螺基因組,評(píng)價(jià)LFD-RPA方法的最低檢出混合度。分別取毛蚴感染后不同時(shí)期釘螺樣本,用解剖鏡檢法判斷釘螺感染情況,提取釘螺樣本DNA,評(píng)價(jià)LFD-RPA方法對(duì)釘螺不同感染階段的血吸蟲(chóng)核酸檢測(cè)能力,進(jìn)行RPA、PCR的平行檢測(cè)。
LFD-RPA方法檢測(cè)現(xiàn)場(chǎng)采集的釘螺樣本,RPA、PCR為平行對(duì)照,評(píng)價(jià)LFD-RPA方法的檢測(cè)效果。以曼氏血吸蟲(chóng)SmCOX1為靶基因,結(jié)合Primer Premier 5軟件、手工輔助設(shè)計(jì)篩選引物,確定最終引物序列,初步建立RPA檢測(cè)方法。以RPA檢測(cè)為基礎(chǔ),設(shè)計(jì)探針,確定反應(yīng)條件,初步建立LFD-RPA檢測(cè)方法。
以文獻(xiàn)中針對(duì)曼氏血吸蟲(chóng)Sm1-7基因設(shè)計(jì)的引物為基礎(chǔ),設(shè)計(jì)特異性探針,探索反應(yīng)溫度及時(shí)間,建立LFD-RPA檢測(cè)方法。以PCR為平行對(duì)照,評(píng)價(jià)建立方法的最低檢出限及與特異性。建立40尾、80尾曼氏血吸蟲(chóng)尾蚴梯度感染小鼠的動(dòng)物模型（簡(jiǎn)稱“40尾組”、“80尾組”）,并于感染后不同時(shí)間收集小鼠糞便及血清,提取DNA,用PCR、RPA、LFD-RPA方法進(jìn)行平行檢測(cè),全面評(píng)價(jià)LFD-RPA方法檢測(cè)曼氏血吸蟲(chóng)早期感染的效能。
隨后,收集本實(shí)驗(yàn)室常用的血吸蟲(chóng)核酸檢測(cè)生物學(xué)技術(shù)的基礎(chǔ)數(shù)據(jù),包括需要的試劑盒或主要試劑的具體名稱、單盒價(jià)格、單盒反應(yīng)次數(shù)以及來(lái)源。計(jì)算不同檢測(cè)方法的每個(gè)樣本投入成本,包括每個(gè)樣本檢測(cè)所需的試劑成本、勞動(dòng)力成本。以每個(gè)樣本投入試劑成本、勞動(dòng)力成本為基礎(chǔ),在設(shè)置陰參、陽(yáng)參的單個(gè)樣本檢測(cè)情況下,計(jì)算每次檢測(cè)投入試劑成本、勞動(dòng)力成本。同時(shí),將96個(gè)反應(yīng)作為不同檢測(cè)方法批量檢測(cè)總量。
計(jì)算批量檢測(cè)情況下,每個(gè)樣本檢測(cè)投入試劑成本、勞動(dòng)力成本。并按照實(shí)驗(yàn)所需儀器數(shù)量將每種方法的技術(shù)要求劃分為簡(jiǎn)單、一般、復(fù)雜、極復(fù)雜四個(gè)等級(jí),對(duì)LFD-RPA和其他核酸檢測(cè)方法的成本和技術(shù)要求進(jìn)行比較分析。
結(jié)果:成功建立了以日本血吸蟲(chóng)SjR2、SjG55A為靶基因的LFD-RPA檢測(cè)方法以及以曼氏血吸蟲(chóng)SmCOX1、Sm1-7為靶基因的LFD-RPA檢測(cè)方法,各方法的反應(yīng)參數(shù)均為39℃、20min。冰上靜置、滴加DNA提取液或酚氯仿三種終止LFD-RPA反應(yīng)的方式對(duì)檢測(cè)結(jié)果無(wú)影響。
以SjR2、SjG55A為靶基因建立的LFD-RPA方法對(duì)含有日本血吸蟲(chóng)靶基因的質(zhì)粒和成蟲(chóng)基因組最低檢出限分別為1copies/μl、102copies/μl和1fg/μl、10fg/μl,SjR2-LFD-RPA更佳,優(yōu)于對(duì)應(yīng)RPA、PCR方法。SjG55A-LFD-RPA方法與曼氏血吸蟲(chóng)、陽(yáng)性雙臍螺、埃及血吸蟲(chóng)、華支睪吸蟲(chóng)、大片吸蟲(chóng)、衛(wèi)氏并殖吸蟲(chóng)基因組DNA均無(wú)交叉反應(yīng)。
SjR2-LFD-RPA方法和埃及血吸蟲(chóng)、華支睪吸蟲(chóng)、大片吸蟲(chóng)、衛(wèi)氏并殖吸蟲(chóng)基因組DNA無(wú)交叉反應(yīng),但可檢出曼氏血吸蟲(chóng)、陽(yáng)性雙臍螺,提示與曼氏血吸蟲(chóng)有交叉反應(yīng)。SjR2-LFD-RPA、SjG55A-LFD-RPA分別能最低檢出2000只、1500只陰性釘螺中的1只陽(yáng)性釘螺,最低檢出混合度均高于對(duì)應(yīng)RPA、PCR。SjR2-LFD-RPA、SjR2-RPA、PCR方法均可檢出20組1:50的混合陽(yáng)性釘螺,3中方法的敏感性均為100%。
參考文獻(xiàn)
[1]Diagnosis of Schistosoma mansoni infections:what are the choices in Brazilian low-endemic areas?[J].Silva-Moraes Vanessa,Shollenberger Lisa M,Siqueira Liliane Maria Vidal,Castro-Borges William,Harn Donald A,Grenfell Rafaella Fortini Queiroz E,Rabello Ana Lucia Teles,Coelho Paulo Marcos Zech.Memorias do Instituto Oswaldo Cruz.2019
[2]Potential Impact of Climate Change on Schistosomiasis:A Global Assessment Attempt.[J].Yang Guo-Jing,Bergquist Robert.Tropical medicine and infectious disease.2018(4)
[3]Point-of-Care Periodontitis Testing:Biomarkers,Current Technologies,and Perspectives[J].Wanghong He,Minli You,Wanting Wan,Feng Xu,Fei Li,Ang Li.Trends in Biotechnology.2018
[4]Development of a lateral flow recombinase polymerase assay for the diagnosis of Schistosoma mansoni infections[J].Kate Poulton,Bonnie Webster.Analytical Biochemistry.2018
[5]王麗萍.基于LFD-RPA的主要腸道血吸蟲(chóng)核酸快速可視化檢測(cè)方法的建立及初步評(píng)價(jià)[D].中國(guó)疾病預(yù)防控制中心,2021.