背景[1-3]
人白細(xì)胞介素-2(IL-2)ELISA試劑盒采用夾心法酶聯(lián)免疫吸附法，用于體外定量分析人血清、血漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清、細(xì)胞裂解液中IL-2的含量。
原理：預(yù)先包被的抗體為IL-2單克隆抗體。檢測(cè)相抗體為IL-2多克隆抗體，經(jīng)生物素標(biāo)記。樣品和生物素標(biāo)記抗體先后加入酶標(biāo)板孔反應(yīng)后，PBS或TBS洗滌。隨后加入過(guò)氧化物酶標(biāo)記的親和素反應(yīng)；經(jīng)過(guò)PBS或TBS的徹底洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過(guò)氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zuì終的黃色。顏色的深淺和樣品中的IL-2呈正相關(guān)。
人白細(xì)胞介素-2(IL-2)ELISA試劑盒
IL-2即白細(xì)胞介素-2（interleukin-2，IL-2），又名T細(xì)胞生長(zhǎng)因子(T cell growth factor，TCRF).主要由活化的CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生的具有廣泛生物活性的細(xì)胞因子.是所有T細(xì)胞亞群的生長(zhǎng)因子，并可促進(jìn)活化B細(xì)胞增殖，故為調(diào)控免疫應(yīng)答的重要因子，也參與抗體反應(yīng)、造血和腫瘤監(jiān)視.環(huán)孢素等免疫抑制劑可以抑制其活性和生成。
白介素2首先被發(fā)現(xiàn)對(duì)骨髓來(lái)源的T細(xì)胞有生長(zhǎng)促進(jìn)作用。此后，發(fā)現(xiàn)IL-2的作用譜越來(lái)越廣，包括對(duì)T、B細(xì)胞、NK細(xì)胞、LAK細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞都有直接的促進(jìn)生長(zhǎng)和分化作用。作用通過(guò)細(xì)胞膜上的IL-2受體而實(shí)現(xiàn)。由于IL-2對(duì)免疫系統(tǒng)所具有的廣泛作用，其在臨床上有著良好的應(yīng)用。人的IL-2的前體有153個(gè)氨基酸。成熟形態(tài)有133個(gè)氨基酸，分子量為15.5KDa的糖蛋白。
應(yīng)用[4][5]
用于人白介素-2和人血清白蛋白融合蛋白在中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞中的表達(dá)研究
利用畢赤酵母對(duì)人白介素-2（IL-2）和人血清白蛋白（HSA）融合蛋白進(jìn)行表達(dá),分別將IL-2連在HSA的N-端（IL-2-HSA）和C-端（HSA-IL-2）得到的融合蛋白都具有良好的生物學(xué)活性,其半衰期也由IL-2單體的6.9 min延長(zhǎng)至13.24 h。但在研究中發(fā)現(xiàn),畢赤酵母在表達(dá)HSA融合蛋白時(shí)存在蛋白降解、產(chǎn)物不均一和過(guò)度糖基化等現(xiàn)象,導(dǎo)致分離純化困難,活性下降以及半衰期縮短等問(wèn)題,這些不利因素限制了畢赤酵母在表達(dá)IL-2融合蛋白中的應(yīng)用。
目前中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞（Chinese hamster ovary,CHO）已成功應(yīng)用于多種藥物蛋白的表達(dá),因此本研究將IL-2和HSA的融合蛋白在CHO細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá),對(duì)篩選得到的工程細(xì)胞株的生長(zhǎng)狀態(tài)和蛋白表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè),同時(shí)對(duì)融合蛋白的分離純化策略和生物活性進(jìn)行了分析。
本研究利用基因工程技術(shù)構(gòu)建兩種不同連接方式的融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒,并通過(guò)電轉(zhuǎn)染的方法分別轉(zhuǎn)入CHO細(xì)胞中,經(jīng)過(guò)四次克隆篩選和搖瓶終篩獲得了高效表達(dá)HSA-IL-2融合蛋白的細(xì)胞株CHO/p MH3-HSA-IL-2/9和表達(dá)IL-2-HSA融合蛋白的細(xì)胞株CHO/p MH3-IL-2-HSA/8。進(jìn)行Western blot檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)兩種融合蛋白都具有HSA和IL-2雙重免疫原性,CTLL-2/MTT法檢測(cè)發(fā)現(xiàn),篩選得到的細(xì)胞株分泌表達(dá)的融合蛋白都具有一定的生物活性。
對(duì)篩選得到的細(xì)胞株進(jìn)行3 L搖瓶流加培養(yǎng),CHO/p MH3-HSA-IL-2/9和CHO/p MH3-IL-2-HSA/8在流加培養(yǎng)期間細(xì)胞密度最高分別達(dá)到6.4×106 cells·m L-1和6.7×106 cells·m L-1,七天積累表達(dá)量分別為138 mg·L-1和118 mg·L-1,SDS-PAGE和Western blot檢測(cè)未發(fā)現(xiàn)明顯的降解條帶。對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行分離純化,初步確定了融合蛋白的分離純化步驟:發(fā)酵液經(jīng)離心、微濾后,再依次經(jīng)過(guò)Blue Sepharose、Phenyl Sepharose和Q Sepharose層析,獲得的融合蛋白HSA-IL-2和IL-2-HSA純度分別為96.5%和95.3%,純化回收率分別為17.29%和14.77%。CTLL-2/MTT法檢測(cè)融合蛋白生物活性,HSA-IL-2的比活性約為1.03×107 IU·mg-1,IL-2-HSA約為8.3×106 IU·mg-1,與畢赤酵母表達(dá)IL-2-HSA融合蛋白的生物活性水平基本相當(dāng)。
參考文獻(xiàn)
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